Gen teslimi - Gene delivery
| Bir kısmı bir dizi üzerinde |
| Genetik mühendisliği |
|---|
 |
| Genetiği değiştirilmiş Organizmalar |
| Tarih ve düzenleme |
| İşlem |
| Uygulamalar |
| tartışmalar |
Gen teslimi , DNA veya RNA gibi yabancı genetik materyalin konakçı hücrelere verilmesi işlemidir . Gen aktarımı, gen ekspresyonunu indüklemek için konakçı hücrenin genomuna ulaşmalıdır . Başarılı gen aktarımı, yabancı gen aktarımının konakçı hücre içinde sabit kalmasını gerektirir ve genoma entegre olabilir veya ondan bağımsız olarak çoğalabilir. Bu , istenen konakçı hücreye girmek ve transgeni o hücrenin genomuna iletmek için tasarlanmış bir vektörün parçası olarak yabancı DNA'nın sentezlenmesini gerektirir . Gen aktarımı için yöntem olarak kullanılan vektörler, rekombinant virüsler ve sentetik vektörler (viral ve viral olmayan) olmak üzere iki kategoriye ayrılabilir.
Karmaşık çok hücreli ökaryotlarda (daha spesifik olarak Weissmanistler ), eğer transgen , konağın germline hücrelerine dahil edilirse , ortaya çıkan konakçı hücre, transgeni kendi soyuna geçirebilir . Transgen somatik hücrelere dahil edilirse, transgen somatik hücre hattında ve dolayısıyla konakçı organizmasında kalacaktır.
Gen aktarımı, hastalarda terapötik bir sonucu teşvik etmek için bir genin eklenmesi veya susturulması için gen terapisinde gerekli bir adımdır ve ayrıca ekinlerin genetik modifikasyonunda uygulamaları vardır. Çeşitli hücre ve doku türleri için birçok farklı gen aktarımı yöntemi vardır.
Tarih
Viral tabanlı vektörler, 1980'lerde transgen ekspresyonu için bir araç olarak ortaya çıktı. 1983'te Albert Siegel, cDNA klonlama yoluyla viral manipülasyon henüz mevcut olmasa da, bitki transgen ekspresyonunda viral vektörlerin kullanımını tanımladı. Bir aşı vektörü olarak kullanılan ilk virüs, şempanzeleri hepatit B'ye karşı korumanın bir yolu olarak 1984'te aşı virüsüydü . Viral olmayan gen aktarımı ilk olarak 1943'te Avery ve ark. eksojen DNA maruziyeti yoluyla hücresel fenotip değişikliği gösterdi .
yöntemler
Genleri konakçı hücrelere ulaştırmak için çeşitli yöntemler mevcuttur. Genlerin bakterilere veya bitkilere verilmesine transformasyon , hayvanlara gen verilmesinde kullanılmasına ise transfeksiyon denir . Bunun nedeni, dönüşümün hayvanlarla ilgili olarak, kanserli bir duruma ilerlemeyi gösteren farklı bir anlama sahip olmasıdır . Bazı bakteriler için, yabancı DNA'yı doğal olarak alabildikleri için, genleri sokmak için hiçbir harici yönteme gerek yoktur . Çoğu hücre, hücre zarını DNA'ya geçirgen hale getirmek ve DNA'nın konakçı genomuna kararlı bir şekilde yerleştirilmesine izin vermek için bir tür müdahaleye ihtiyaç duyar .
Kimyasal
Kimyasal bazlı gen iletim yöntemleri, genlerin hücrelere transferini kolaylaştıran partiküller oluşturmak için doğal veya sentetik bileşikleri kullanabilir. Bu sentetik vektörler, DNA veya RNA'yı elektrostatik olarak bağlama ve daha büyük genetik transferleri barındırmak için genetik bilgiyi sıkıştırma yeteneğine sahiptir. Kimyasal vektörler genellikle hücrelere endositoz yoluyla girer ve genetik materyali bozulmadan koruyabilir.
Isı şoku
En basit yöntemlerden biri hücrenin ortamını değiştirmek ve ardından hücreye ısı şoku vererek hücreyi strese sokmak . Tipik olarak hücreler, bir ısı darbesine maruz bırakılmadan önce soğuk koşullar altında iki değerlikli katyonlar (genellikle kalsiyum klorür ) içeren bir çözelti içinde inkübe edilir . Kalsiyum klorür, rekombinant DNA'nın konak hücreye girmesine izin veren hücre zarını kısmen bozar. Hücrelerin soğuk durumda iki değerlikli katyonlara maruz bırakılmasının hücre yüzey yapısını değiştirebileceği veya zayıflatarak DNA'ya daha geçirgen hale getirebileceği ileri sürülmektedir. Isı darbesinin hücre zarı boyunca, DNA'yı hücre gözeneklerinden veya hasarlı hücre duvarından hücrelere girmeye zorlayan bir termal dengesizlik yarattığı düşünülmektedir.
Kalsiyum fosfat
Başka bir basit yöntem, DNA'yı bağlamak için kalsiyum fosfat kullanmayı ve ardından onu kültürlenmiş hücrelere maruz bırakmayı içerir. Çözelti, DNA ile birlikte hücreler tarafından kapsüllenir ve az miktarda DNA genoma entegre edilebilir.
Lipozomlar ve polimerler
Lipozomlar ve polimerler , DNA'yı hücrelere iletmek için vektörler olarak kullanılabilir. Pozitif yüklü lipozomlar, negatif yüklü DNA ile bağlanırken, DNA ile etkileşime giren polimerler tasarlanabilir. Sırasıyla lipopleksler ve polipleksler oluştururlar ve bunlar daha sonra hücreler tarafından alınır. İki sistem de birleştirilebilir. Polimer bazlı viral olmayan vektörler, DNA ile etkileşime girmek ve polipleksler oluşturmak için polimerleri kullanır.
nanopartiküller
Tasarlanmış inorganik ve organik nanopartiküllerin kullanımı, gen aktarımı için başka bir viral olmayan yaklaşımdır.
Fiziksel
Yapay gen dağıtımına, genetik materyali hücre zarından sokmak için kuvvet kullanan fiziksel yöntemlerle aracılık edilebilir.
elektroporasyon
Elektroporasyon , yetkinliği arttırmanın bir yöntemidir . Hücreler , hücre zarında plazmit DNA'nın girebileceği delikler oluşturduğu düşünülen 10-20 kV /cm'lik bir elektrik alanı ile kısa bir süre şoklanır . Elektrik çarpmasından sonra, delikler hücrenin zar onarım mekanizmaları tarafından hızla kapatılır.
biyolistik
Bitki hücrelerini dönüştürmek için kullanılan başka bir yöntem , altın veya tungsten parçacıklarının DNA ile kaplandığı ve daha sonra genç bitki hücrelerine veya bitki embriyolarına püskürtüldüğü biyolistiktir . Bazı genetik materyaller hücrelere girer ve onları dönüştürür. Bu yöntem Agrobacterium enfeksiyonuna duyarlı olmayan bitkilerde kullanılabilir ve ayrıca bitki plastidlerinin transformasyonuna izin verir . Bitki hücreleri, hücre zarını plazmit DNA'ya geçirgen hale getirmek için bir elektrik şoku kullanan elektroporasyon kullanılarak da dönüştürülebilir. Hücrelere ve DNA'ya verilen hasar nedeniyle biyolistik ve elektroporasyonun dönüşüm verimliliği, agrobakteriyel dönüşümden daha düşüktür.
mikroenjeksiyon
Mikroenjeksiyon , DNA'nın hücrenin nükleer zarfından doğrudan çekirdeğe enjekte edildiği yerdir .
sonoporasyon
Sonoporasyon , genetik materyalin girişine izin vermek için bir hücre zarında gözenekler oluşturan ses dalgalarını kullanır.
fotoporasyon
Fotoporasyon , genetik materyalin girişine izin vermek için bir hücre zarında gözenekler oluşturmak için lazer darbelerinin kullanıldığı zamandır .
manyetofeksiyon
Magnetofection , DNA ile kompleks oluşturan manyetik partikülleri ve harici bir manyetik alan konsantresi nükleik asit partiküllerini hedef hücrelere kullanır.
hidroporasyon
Hücre geçirgenliğini manipüle etmek için bir hidrodinamik kılcal etki kullanılabilir.
agrobakteri
Bitkilerde DNA, genellikle kullanılarak sokulur Agrobacterium rekombinasyon aracılı yararlanarak, Agrobacterium'un s , T-DNA bitki hücrelerine genetik malzemenin doğal sokulmasını sağlar dizisi. Bitki dokusu küçük parçalar halinde kesilir ve süspansiyon halindeki Agrobacterium içeren bir sıvıya batırılır . Bakteriler, kesiklerin maruz kaldığı birçok bitki hücresine yapışacaktır. Bakteri, T-DNA adı verilen bir DNA segmentini plazmitinden bitkiye aktarmak için konjugasyon kullanır . Aktarılan DNA, bitki hücre çekirdeğine yönlendirilir ve konukçu bitki genomik DNA'sına entegre edilir. Plazmit T-DNA, konukçu hücrenin genomuna yarı rasgele entegre edilir .
Araştırmacılar, ilgilenilen geni ifade etmek için plazmidi değiştirerek, seçtikleri geni bitki genomuna kararlı bir şekilde yerleştirebilirler. T-DNA'nın tek temel parçası, en az biri bitki dönüşümü için gerekli olan iki küçük (25 baz çifti) sınır tekrarıdır. Bitkiye dahil edilecek genler , plazmitin T-DNA bölgesini içeren bir bitki transformasyon vektörüne klonlanır . Alternatif bir yöntem, agroinfiltrasyondur .
viral dağıtım
Virüs aracılı gen aktarımı, bir virüsün DNA'sını bir konak hücrenin içine enjekte etme yeteneğini kullanır ve virüsün kendi genetik materyallerini kopyalama ve uygulama yeteneğinden yararlanır. Viral gen aktarımı yöntemlerinin bir bağışıklık tepkisini indükleme olasılığı daha yüksektir, ancak yüksek verimliliğe sahiptirler. Transdüksiyon , DNA'nın konak hücreye virüs aracılı eklenmesini tanımlayan süreçtir. Virüslerin yapısı , konak hücrenin çekirdeğine ilettiği DNA'nın lizozomları yoluyla bozulmayı önlediğinden, virüsler özellikle etkili bir gen aktarımı biçimidir . Gen terapisinde, verilmesi amaçlanan bir gen, bir viral vektör oluşturmak üzere replikasyondan yoksun bir viral partikül içine paketlenir . Bugüne kadar gen tedavisi için kullanılan virüsler arasında retrovirüs, adenovirüs, adeno-ilişkili virüs ve herpes simpleks virüsü yer alır. Bununla birlikte, genleri hücrelere iletmek için virüsleri kullanmanın sakıncaları vardır. Virüsler hücrelere sadece çok küçük DNA parçaları verebilir, yoğun emek gerektirir ve rastgele yerleştirme bölgeleri, sitopatik etkiler ve mutajenez riskleri vardır .
Viral vektör bazlı gen dağıtımı, genetik materyali konak hücreye iletmek için bir viral vektör kullanır . Bu, istenen geni içeren bir virüs kullanılarak ve virüs genomunun bulaşıcı olan kısmını çıkararak yapılır. Virüsler, replikasyon için hayati önem taşıyan konak hücrenin çekirdeğine genetik materyal vermede etkilidir.
RNA bazlı viral vektörler
RNA bazlı virüsler, doğrudan enfeksiyöz RNA transkriptlerinden kopyalanma kabiliyeti nedeniyle geliştirilmiştir. RNA vektörleri, herhangi bir işleme gerekmediğinden hızlı bir şekilde ifade edilir ve hedeflenen biçimde ifade edilir. Gen entegrasyonu, uzun vadeli transgen ekspresyonuna yol açar, ancak RNA bazlı teslimat genellikle geçicidir ve kalıcı değildir. Retroviral vektörler, oncoretroviral, lentiviral ve insan köpüklü virüsünü içerir .
DNA tabanlı viral vektörler
DNA bazlı viral vektörler, genoma entegre olma olasılığı ile genellikle daha uzun ömürlüdür. DNA bazlı viral vektörler arasında Adenoviridae , adeno-ilişkili virüs ve herpes simpleks virüsü bulunur .
Uygulamalar
Gen tedavisi
Gen aktarımını kolaylaştırmak için kullanılan yöntemlerin birçoğunun terapötik amaçlar için uygulamaları vardır. Gen terapisi , hücredeki bir hastalığı veya durumu tedavi etmek amacıyla genetik materyali iletmek için gen aktarımını kullanır. Terapötik ortamlarda gen aktarımı , istenen etkiye neden olmak için yeterli miktarda transgen ekspresyonu sağlayabilen hücre spesifikliğine sahip immünojenik olmayan vektörleri kullanır .
Genomikteki ilerlemeler, olası uygulamalar için çeşitli yeni yöntemlerin ve gen hedeflerinin tanımlanmasını sağlamıştır. DNA mikro çeşitli kullanılan yeni nesil dizileme analitik yazılım gen ekspresyonu bakarken, eş zamanlı olarak binlerce gen belirleyebilir ve orthologou s genler model tür işlevini tanımlamak için. Bu, gen terapisinde kullanım için çeşitli olası vektörlerin tanımlanmasına izin verdi. Yeni bir aşı sınıfı oluşturmak için bir yöntem olarak , olası bir aşıyı vermek üzere bir hibrit biyosentetik vektör oluşturmak için gen aktarımı kullanılmıştır . Bu vektör , hedef hücre lizozomları tarafından bozunmayı önlemek için artan bir yeteneğe sahipken, plazmit DNA'yı koruyan bir vektör oluşturmak için E. coli'yi sentetik bir polimer ile birleştirerek gen dağıtımının önündeki geleneksel engellerin üstesinden gelir .
Ayrıca bakınız
Referanslar
daha fazla okuma
- Segura T, Shea LD (2001). "Viral olmayan gen dağıtımı için malzemeler". Malzeme Araştırmalarının Yıllık Gözden Geçirilmesi . 31 : 25–46. Bibcode : 2001AnRMS..31...25S . doi : 10.1146/annurev.matsci.31.1.25 .
- Luo D, Saltzman WM (Ocak 2000). "Sentetik DNA dağıtım sistemleri". Doğa Biyoteknolojisi . 18 (1): 33–7. doi : 10.1038/71889 . PMID 10625387 . S2CID 7068508 .