Transkripsiyon aktivatör benzeri efektör nükleaz - Transcription activator-like effector nuclease
| Bir kısmı bir dizi üzerinde |
| Genetik mühendisliği |
|---|
 |
| Genetiği değiştirilmiş Organizmalar |
| Tarih ve düzenleme |
| İşlem |
| Uygulamalar |
| tartışmalar |
Transkripsiyon aktivatör benzeri efektör nükleazlar ( TALEN ), spesifik DNA dizilerini kesmek için tasarlanabilen kısıtlama enzimleridir . Bir TAL efektör DNA bağlama alanının bir DNA bölünme alanına ( DNA ipliklerini kesen bir nükleaz ) kaynaştırılmasıyla yapılırlar . Transkripsiyon aktivatör benzeri efektörler (TALE'ler), pratik olarak herhangi bir istenen DNA dizisine bağlanacak şekilde tasarlanabilir, böylece bir nükleaz ile birleştirildiğinde, DNA belirli yerlerde kesilebilir. Kısıtlama enzimleri, gen düzenlemede veya in situ genom düzenlemede kullanılmak üzere hücrelere dahil edilebilir, mühendislik nükleazlarla genom düzenleme olarak bilinen bir teknik . Çinko parmak nükleazları ve CRISPR/Cas9'un yanı sıra TALEN , genom düzenleme alanında öne çıkan bir araçtır .
TALE DNA-bağlanma alanı
TAL efektörler tarafından salgılanan proteinlerdir Xanthomonas kendi üzerinden bakteri tip III salgılama sistemine de zaman bitkileri enfekte . DNA bağlanma alanı, farklı 12. ve 13. amino asitlerle tekrarlanan yüksek oranda korunmuş 33-34 amino asit dizisi içerir. Tekrar Değişkeni Duruşu (RVD) olarak adlandırılan bu iki pozisyon oldukça değişkendir ve spesifik nükleotid tanıma ile güçlü bir korelasyon gösterir . Amino asit dizisi ve DNA tanıma arasındaki bu doğrudan ilişki, uygun RVD'leri içeren tekrar bölümlerinin bir kombinasyonunu seçerek spesifik DNA-bağlama alanlarının mühendisliğine izin vermiştir. Özellikle, RVD'deki küçük değişiklikler ve "geleneksel olmayan" RVD dizilerinin dahil edilmesi, hedefleme özgüllüğünü iyileştirebilir.
DNA bölünme alanı
FokI endonükleazının sonundan gelen spesifik olmayan DNA bölünme alanı, bir maya deneyinde aktif olan hibrit nükleazları oluşturmak için kullanılabilir. Bu reaktifler ayrıca bitki hücrelerinde ve hayvan hücrelerinde de aktiftir. İlk TALEN çalışmaları, vahşi tip FokI bölünme alanını kullandı, ancak sonraki bazı TALEN çalışmaları, bölünme özgüllüğünü ve bölünme aktivitesini iyileştirmek için tasarlanmış mutasyonlara sahip FokI bölünme alanı varyantlarını da kullandı. FokI alanı bir dimer olarak işlev görür ve hedef genomdaki uygun oryantasyon ve aralıklı siteler için benzersiz DNA bağlama alanlarına sahip iki yapı gerektirir. Hem TALE DNA bağlanma alanı ile FokI bölünme alanı arasındaki amino asit kalıntılarının sayısı hem de iki ayrı TALEN bağlanma sahası arasındaki bazların sayısı, yüksek aktivite seviyelerine ulaşmak için önemli parametreler olarak görünmektedir.
Mühendislik TALEN inşaatları
Amino asit dizisi ve TALE bağlanma alanının DNA tanıması arasındaki basit ilişki, proteinlerin verimli mühendisliğine izin verir. Bu durumda, yapay gen sentezi , TALE bağlama alanında bulunan tekrarlayan dizinin yanlış tavlanması nedeniyle sorunludur . Buna bir çözüm hesaplamak için genel olarak uygun bir yazılım programı (DNAWorks) kullanmaktır oligonükleotidler , iki aşamalı bir montaj için uygun PCR takımı bütün gen amplifikasyonu takiben oligonükleotid. Tasarlanmış TALE yapıları oluşturmak için bir dizi modüler montaj şeması da rapor edilmiştir. Her iki yöntem de, çinko parmak DNA tanıma alanları oluşturmak için modüler birleştirme yöntemine kavramsal olarak benzer olan mühendislik DNA bağlama alanları için sistematik bir yaklaşım sunar .
transfeksiyon
TALEN yapıları birleştirildikten sonra plazmitlere eklenirler ; hedef hücreler daha sonra plazmitlerle transfekte edilir ve gen ürünleri eksprese edilir ve genoma erişmek için çekirdeğe girer. Alternatif olarak, TALEN yapıları hücrelere mRNA'lar olarak iletilebilir, bu da TALEN eksprese eden proteinin genomik entegrasyonu olasılığını ortadan kaldırır. Bir mRNA vektörünün kullanılması, homolojiye yönelik onarım (HDR) seviyesini ve gen düzenlemesi sırasında introgresyonun başarısını önemli ölçüde artırabilir.
genom düzenleme
mekanizmalar
TALEN, hücrelerin onarım mekanizmalarıyla yanıt verdiği çift zincirli kırılmaları (DSB) indükleyerek genomları düzenlemek için kullanılabilir.
Homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ), tavlama için çok az dizi örtüşmesinin olduğu veya hiç olmadığı bir çift sarmal kopmasının her iki tarafından DNA'yı doğrudan bağlar. Bu onarım mekanizması, indeller (yerleştirme veya silme) veya kromozomal yeniden düzenleme yoluyla genomda hatalara neden olur ; bu tür hatalar, o konumda kodlanan gen ürünlerini işlevsiz hale getirebilir. Bu aktivite kullanılan türe, hücre tipine, hedef gene ve nükleaza göre değişebileceğinden, yeni sistemler tasarlanırken izlenmelidir. PCR ile amplifiye edilen iki alel arasındaki herhangi bir farkı saptayan basit bir heterodupleks klevaj tahlili çalıştırılabilir. Bölünme ürünleri, basit agaroz jeller veya slab jel sistemleri üzerinde görselleştirilebilir.
Alternatif olarak DNA, eksojen çift sarmallı DNA parçalarının varlığında NHEJ yoluyla bir genoma dahil edilebilir.
Homolojiye yönelik onarım , DSB'ye yabancı DNA'yı da sokabilir, çünkü transfekte edilmiş çift sarmallı diziler, onarım enzimleri için şablonlar olarak kullanılır.
Uygulamalar
TALEN, bitki genomlarını verimli bir şekilde modifiye etmek ve uygun besin özelliklerine sahip ekonomik açıdan önemli gıda mahsulleri yaratmak için kullanılmıştır. Biyoyakıt üretimi için araçlar geliştirmek için de kullanıldılar . Ek olarak, nakavt C. elegans , nakavt sıçanlar , nakavt fareler ve nakavt zebra balığı üretmek için stabil şekilde modifiye edilmiş insan embriyonik kök hücre ve indüklenmiş pluripotent kök hücre (IPSC'ler) klonları ve insan eritroid hücre hatları mühendisliği yapmak için kullanılmıştır . Ayrıca, yöntem, nakavt organizmalar üretmek için kullanılabilir. Wu ve arkadaşları, artan tüberküloz direncini indüklemek için Talen nickazlarını kullanan bir Sp110 nakavt sığırı elde etti. Bu yaklaşım aynı zamanda tek hücreli embriyolarda TALEN mRNA mikroenjeksiyonu ile nakavt fareler oluşturmak için de kullanılmıştır.
TALEN, hastalığın altında yatan genetik hataları düzeltmek için deneysel olarak da kullanılmıştır. Örneğin, orak hücre hastalığı , kseroderma pigmentosum ve epidermolizis bülloza gibi bozukluklara neden olan genetik kusurları düzeltmek için in vitro olarak kullanılmıştır . Son zamanlarda, TALEN'in kanserlerle savaşmak için bağışıklık sistemini harekete geçirmek için bir araç olarak kullanılabileceği gösterildi; TALEN aracılı hedefleme, kemoterapötik ilaçlara dirençli ve anti-tümör aktivitesi gösteren T hücreleri üretebilir.
Teoride, tasarlanmış TALEN füzyonlarının genom çapında özgüllüğü, doğru bir eksojen şablondan homolojiye yönelik onarım yoluyla bireysel genetik lokuslardaki hataların düzeltilmesine izin verir. Ancak gerçekte, TALEN'in yerinde uygulaması şu anda verimli bir dağıtım mekanizmasının olmaması, bilinmeyen immünojenik faktörler ve TALEN bağlanmasının özgüllüğündeki belirsizlik nedeniyle sınırlıdır.
Talen bir diğer yükselen uygulaması gibi diğer genom mühendislik araçları ile birleştirmek yeteneğidir meganucleases . Bir TAL efektörünün DNA bağlama bölgesi, mühendislik kolaylığı ve bir TAL efektörünün yüksek düzeyde spesifik DNA bağlama aktivitesi ile bir meganükleazın düşük saha frekansı ve özgüllüğünü birleştiren bir hibrit mimari oluşturmak için bir meganükleazın bölünme alanı ile birleştirilebilir.
TALEN, diğer genom düzenleme teknikleri ile karşılaştırıldığında, zorluk ve maliyet açısından ortada kalmaktadır. ZFN'lerin aksine , TALEN tek nükleotidleri tanır. TALEN DNA bağlama alanları ve hedef nükleotidleri arasındaki etkileşimleri tasarlamak, ZNF'ler ve onların hedef nükleotid üçlüleri ile etkileşimler oluşturmaktan çok daha basittir. Öte yandan, CRISPR , protein/DNA tanıma yerine ribonükleotid kompleks oluşumuna dayanır. gRNA'lar, hedef dizideki PAM sitelerinin eksikliğinden dolayı zaman zaman fizibilite ile ilgili sınırlamalara sahiptir ve ucuza üretilebilseler de, mevcut gelişme TALEN'ler için önemli bir maliyet düşüşüne yol açmaktadır, böylece benzer bir fiyat ve zaman aralığındadırlar. CRISPR tabanlı genom düzenleme.
TAL efektör nükleaz hassasiyeti
Aktif bir nükleazın hedef dışı aktivitesi, istenmeyen çift zincir kırılmalarına yol açabilir ve sonuç olarak kromozomal yeniden düzenlemelere ve/veya hücre ölümüne yol açabilir. Mevcut teknolojilerin nispi nükleazla ilişkili toksisitesini karşılaştırmak için çalışmalar yapılmıştır. Bu çalışmalara ve DNA bağlanması ile nükleaz aktivitesi arasındaki maksimum teorik mesafeye dayanarak, TALEN yapılarının şu anda mevcut teknolojilerin en yüksek hassasiyetine sahip olduğuna inanılmaktadır.
Ayrıca bakınız
Referanslar
Dış bağlantılar
- E-TALEN.org TALEN tasarımı için kapsamlı bir araç
- Ayın PDB Molekülü Protein Veritabanının aylık yapısal vurgusuna bir giriş