KcsA potasyum kanalı - KcsA potassium channel
KcsA ( K c hannel of s treptomyces A ), iyon kanalı araştırmalarında yoğun olarak incelenen toprak bakterisi Streptomyces lividans'tan prokaryotik bir potasyum kanalıdır . PH, aktive edilmiş protein, iki sahip transmembran segman ve son derece seçici bir gözenek bölgesi, geçitleme sorumlu ve K mekik + hücre dışına iyonları. KcsA'nın seçicilik filtresinde bulunan amino asit dizisi, hem prokaryotik hem de ökaryotik K + voltaj kanalları arasında yüksek oranda korunur ; sonuç olarak, KcsA üzerine yapılan araştırmalar, K + iyonu seçimi ve iletimi için moleküler temel üzerine önemli yapısal ve mekanik anlayış sağlamıştır . Bugüne kadar en çok çalışılan iyon kanallarından biri olan KcsA, K + kanal işlevi üzerine araştırma için bir şablondur ve onun açıklanmış yapısı, hem prokaryotik hem de ökaryotik türler için kanal dinamiklerinin hesaplamalı modellemesinin temelini oluşturur.
| KcsA Potasyum Kanalı | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Kanalı oluşturan dört alt birim farklı renklerde çizilir. Alt birimlerin her birinden gelen P-döngülerinden oluşan seçicilik filtresi tarafından korunan merkezi bir gözenek çevrelerler. Mavi ve kırmızı noktalar, lipid çift tabakasının sınırlarını gösterir .
| |||||||||
| tanımlayıcılar | |||||||||
| Sembol | KcsA | ||||||||
| Pfam | PF07885 | ||||||||
| InterPro | IPR013099 | ||||||||
| SCOP2 | 1bl8 / KAPSAM / SUPFAM | ||||||||
| OPM süper ailesi | 8 | ||||||||
| OPM proteini | 1r3j | ||||||||
| |||||||||
Tarih
KcsA, 1998 yılında Roderick MacKinnon ve meslektaşları tarafından x-ışını kristalografisi kullanılarak karakterize edilen ilk potasyum iyon kanalıydı . Buna giden yıllarda, K + kanallarının yapısı üzerine araştırmalar , küçük toksin bağlanmasının kullanımına odaklandı. kanal kalıntıları arasında gözenek ve seçicilik filtresinin yerini ortaya çıkarır. MacKinnon'ın grubu teorize tetramerik düzenlemesi transmembran segmentlerinin ve hatta etkileşim amino asitlerin kısa segmentten oluşan filtre bölgesinde gözenek oluşturucu “döngü” varlığını gösterdi K + iyonları kanal boyunca güçlü sekans keşfini geçen homoloji arasında KcsA ve Shaker proteini de dahil olmak üzere Kv ailesindeki diğer kanallar, özellikle K + kanal imza dizisi diğer prokaryotik genlerde görünmeye başlayınca bilim camiasının dikkatini çekti . Birçok ökaryotik iyon kanalındaki altının aksine KcsA'daki iki transmembran sarmalın basitliği, K + kanallarının iletim mekanizmalarını daha ilkel bir düzeyde anlamak için bir yöntem sağladı , böylece KcsA çalışması için daha da büyük bir ivme sağladı. .
KcsA'nın kristal yapısı , doğal proteinin (126-158 artıkları) C-terminali sitoplazmik alanının çıkarılmasının kristalize numunelerin stabilitesini arttırdığını keşfettikten sonra 1998'de MacKinnon grubu tarafından çözüldü . 3.2A çözünürlükte bir KcsA modeli, her bir alt birimin bir sarmalı iç eksene ve diğeri dışa bakacak şekilde, proteinin bir merkez gözenek etrafındaki tetramerik düzenlemesini doğrulayan bir model üretildi. Üç yıl sonra, Morais-Cabral ve Zhou tarafından monoklonal Fab fragmanları, kanalı daha da stabilize etmek için KcsA kristallerine bağlandıktan sonra daha yüksek çözünürlüklü bir model üretildi . 2000'li yılların başında, gözenek bölgesini modellemek için yapılan enerji ve elektrostatik hesaplamalara dayalı olarak, taşıma işlemi sırasında seçicilik filtresinin iki K + atomu tarafından işgal edildiğine dair kanıtlar ortaya çıktı. KcsA'nın çeşitli açık ve kapalı, aktif olmayan ve aktif biçimlerinin ssNMR ve EPR gibi diğer görüntüleme yöntemleriyle sürekli olarak araştırılması , o zamandan beri kanal yapısı ve kanal inaktivasyonundan iletime geçişi sağlayan kuvvetler hakkında daha fazla bilgi sağlamıştır.
2007 yılında, Riek et. Al. iyon kanalının pH 7'den pH 4'e titre edilmesinden kaynaklanan kanal açılmasının iki bölgedeki konformasyonel değişikliklere karşılık geldiğini gösterdi: seçicilik filtresinin iyon değiştirme durumuna geçiş ve C'de TM2 düzenlemesinin açılması - terminal . Bu model, KcsA'nın aynı zamanda elektriksel iletkenliği sağlarken K + iyonları için eşzamanlı seçim yapabilme yeteneğini açıklar . 2011'de, tam uzunluktaki KcsA'nın kristal yapısı, önceden kesilmiş kalıntıların engellemesinin, proteinin hücreler arası iyon geçiş bölgesinin yalnızca doğrudan genişlemesine izin verdiğini ortaya çıkarmak için çözüldü. Bu araştırma, iyon iletimi sırasında ayrı kanal bölgelerinin hareketine daha ayrıntılı bir bakış sağlar. Günümüzde, KcsA çalışmaları, hERG dahil olmak üzere daha büyük ökaryotik K + kanallarının kanal dinamikleri için bir model olarak prokaryotik kanalı kullanmaya odaklanmıştır .
Yapı
KCSA bir yapıya sahip olan bir ters çevrilmiş ait koni merkezi bir delik, iki zar oluşan merkezi aşağı çalışan, sarmalları yayılan (dış-heliks M1 ve iç helezon M2), lipit çift katmanı . Kanalın kendisi, bir M2 sarmalının merkezi gözenekle, diğer M1 sarmalının ise lipit zarıyla yüzleşeceği şekilde düzenlenmiş dört özdeş, tek alanlı alt birimden (her biri iki a-helisli) oluşan bir tetramerdir . İç sarmallar, lipid membrana göre yaklaşık 25° eğilir ve hafifçe bükülür, bir çiçek gibi hücrenin dışına bakacak şekilde açılır. Bu iki TM sarmalı, merkezi gözeneklere karşılık gelen ortak bir eksen etrafında simetrik olarak dağılmış bir yeniden giriş döngüsü ile birbirine bağlanır . Gözenek bölgesi yaklaşık 30 amino asit kalıntısını kapsar ve üç bölüme ayrılabilir: hücre dışı tarafa yakın bir seçicilik filtresi , merkezde genişlemiş su dolu bir boşluk ve sitoplazmik tarafa yakın dört paketlenmiş M2 sarmal tarafından oluşturulan kapalı bir kapı. Bu mimari, yüksek potasyum muhafaza edilmesi bulunan kanalı ailesinin hem de ökaryotlar ve prokaryotlar.
Gözeneğin toplam uzunluğu 45 A'dır ve çapı, iç tünelin farklı bölgelerinde önemli ölçüde değişir. Seyahat hücre içi (resimde üst kenarına kadar) dışarı doğru bölgede gözenek membran ortasına yakın geniş bir boşluğun içine (boyunca -10 A) çapı 18 Â M2 sarmallarının oluşturduğu bir kapı bölgesi ile başlar, ve daha sonra açılır . Bu bölgelerde K + iyonları çevredeki su molekülleri ile temas halindedir ancak üstteki seçicilik filtresinden kanala girdiklerinde boşluk o kadar dardır ki K + iyonlarının hücreye girebilmek için hidratlı suları dökmesi gerekir. İle ilgili olarak , amino asit KCSA içinde gözenek astar kalıntılarının bileşimin, iç gözenek ve boşluğunu çevreleyen yan zincirler ağırlıklı olarak hidrofobik ancak seçicilik filtre içinde polar amino asitler bu temas susuz K mevcut + iyonları.
seçicilik filtresi
Koninin daha geniş ucu, gözenekli sarmallardan oluşan kanalın hücre dışı ağzına ve potasyum kanallarının özelliği olan bir TVGYG dizisi (Threonine, Valine , Glycine, Tyrosine, Glycine) tarafından oluşturulan bir seçicilik filtresine karşılık gelir . Bu bölge içinde, TVGYG amino asitleri ile gelen K + iyonları arasındaki koordinasyon , iyonların kanaldan iletilmesine izin verir. KcsA'nın seçicilik filtresi, dört iyon bağlama bölgesi içerir, ancak bu dört pozisyondan sadece ikisinin aynı anda işgal edildiği önerilmiştir. Seçicilik filtresinin çapı yaklaşık 3 Å'dir. olsa moleküler dinamik simülasyonları filtre esnektir. KcsA'nın filtre bölgesinde TVGYG'nin varlığı, daha karmaşık ökaryotik kanallarda bile korunur, böylece KcsA'yı türler arasında K + kanal iletkenliğini incelemek için en uygun sistem haline getirir .
İşlev
KCSA kanal modeli olarak kabul edilir kanal KCSA yapısı K anlamak için bir çerçeve sağlar, çünkü + : üç bölümden oluşmaktadır kanal iletkenliği, potasyum seçicilik , pH duyarlılığı ve voltaj kapılı kanal inaktivasyonu ile yolluk kanalı. K + iyon geçirgenliği ise, gözeneğin üst seçicilik filtre bölgesi meydana pH yolluk yükselir protonasyon ait transmembran gözenek sonunda sarmalları. Düşük pH'da, M2 sarmalı protonlanır ve iyon kanalı kapalı konformasyondan açık konformasyona kaydırılır. İyonlar kanalın içinden akış gibi, gerilim yolluk mekanizması, iletken bir yapıyı destabilize edebilecek ve uzun ömürlü olarak iletken olmayan duruma girişi kolaylaştırmak seçicilik filtre Glu71 ve Asp80 arasındaki etkileşimleri uyardığı düşünülmektedir benzerlik arasında C-tipi-inaktivasyon voltaja bağımlı kanallar .
pH 7'de KcsA'nın iletken olmayan yapısında, K + seçicilik filtresinin koordine edici oksijenlerine sıkıca bağlıdır ve dört TM2 sarmalı , herhangi bir potasyum iyonunun geçişini engellemek için sitoplazmik bağlantı yakınında birleşir . Ancak pH 4'te KcsA, M2 sarmallarının açık ve kapalı biçimleri arasında ve nüfuz eden ve nüfuz etmeyen durumları filtreleyen milisaniyelik zaman ölçeğinde konformasyonel değişimlere uğrar. Bu farklı yapı değişiklikleri kanalının ayrı bölgelerde meydana birlikte, her bir bölgenin moleküler davranışı hem bağlı olan elektrostatik etkileşimler ve allostery . Filtredeki bu değişim stereokimyasal konfigürasyonlarının dinamikleri, eşzamanlı K + iletkenliği ve geçitleme için fiziksel bir temel sağlar .
K + seçicilik
TVGYG dizisi, KcsA'nın potasyum özgüllüğünü korumak için özellikle önemlidir. Bu seçicilik filtre dizisindeki glisinler, filtrenin protein omurgasındaki karbonil oksijen atomlarının gözenek boyunca iyonlara doğru bir yöne işaret etmesine izin veren dihedral açılara sahiptir. Glisinler ve treonin, K + iyonu ile koordine olurken, valin ve tirozinin yan zincirleri, filtreye geometrik kısıtlama getirmek için protein çekirdeğine yönlendirilir. Sonuç olarak, KcsA tetrameri , her biri bir küpün köşelerinde oturan sekiz oksijen atomundan oluşan bir kafesten oluşan dört eşit aralıklı K + bağlanma bölgesini barındırır . Filtredeki K + iyonlarını çevreleyen oksijen atomları , kanal boşluğunda hidratlı K + iyonlarını çevreleyen su molekülleri gibi düzenlenir ; bu, seçicilik filtresindeki oksijen koordinasyonu ve bağlanma bölgelerinin, K + dehidrasyonunun enerjik maliyetini ödediğini gösterir . Na+ iyonu bu K + boyutundaki bağlanma bölgeleri için çok küçük olduğundan , dehidrasyon enerjisi dengelenmez ve bu nedenle filtre diğer yabancı iyonlara karşı seçim yapar. Ek olarak, KcsA kanalı Cs + iyonları tarafından bloke edilir ve geçitleme Mg2 + iyonlarının varlığını gerektirir .
pH Duyarlılığı
KcsA'nın pH'a bağlı iletkenliği, protein daha asidik bir ortama maruz kaldığında iyon kanalının açılmasının meydana geldiğini gösterir. Riek grubu tarafından gerçekleştirilen NMR çalışmaları, pH duyarlılığının proteinin hem C-terminal TM2 bölgesinde hem de seçicilik filtresindeki Tyr78 ve Gly79 kalıntılarında meydana geldiğini göstermektedir. Ana pH sensörünün sitoplazmik alanda olduğunu gösteren kanıtlar vardır. Negatif yüklü amino asitleri nötr olanlar ile değiştirmek, transmembran bölgede amino asit değişiklikleri olmamasına rağmen KcsA kanalını pH'a karşı duyarsız hale getirdi. Ek olarak, pH 6 ile 7 arasında, histidin, histidinlerin titre edilebilir birkaç yan zincirinden biridir; TM2'nin transmembran ve hücre dışı segmentlerinde bulunmazlar, ancak KcsA'nın C-terminalinde bulunurlar. Bu, özellikle C-terminalinden seçicilik filtresine kanal açma sinyalinin konformasyonel yayılımının tüm gözenek boyunca iletkenlik için gerekli yapısal değişiklikleri koordine etmede önemli olabileceğinden, özellikle pH'a duyarlı olan KcsA'nın yavaş açılması için olası bir mekanizmayı vurgular. .
NMR çalışmaları ayrıca KcsA filtre bölgesinde Tyr78, Gly79, Glu71 ve Asp80 arasında karmaşık bir hidrojen bağı ağının bulunduğunu ve ayrıca iletkenlik için pH'a duyarlı bir tetikleyici görevi gördüğünü ileri sürer. E71A da dahil olmak üzere bölgedeki anahtar kalıntıların mutasyonu, KcsA'da Glu71 ve Tyr78 arasındaki hidrojen bağının ve Glu71 ile Asp80 arasındaki su aracılı hidrojen bağının kaybına eşdeğer , 4 kcal mol- 1 gibi büyük bir enerji maliyeti ile sonuçlanır. (E71A). Bu çalışmalar ayrıca KcsA kanal fonksiyonunda pH geçişinin rolünü vurgulamaktadır.
Gerilim Geçişi
2006'da Perozo grubu, voltaj alanlarının KcsA geçitleme üzerindeki etkileri için mekanik bir açıklama önerdi. Kanala depolarize edici bir akım eklendikten sonra, Glu71'in hücre içi gözeneklere doğru yeniden yönlendirilmesi meydana gelir, böylece başlangıçta seçicilik filtresini stabilize eden Glu71-Asp80 karboksil-karboksilat çifti bozulur. Filtre bölgesinin çökmesi, etkisiz hale getirilmiş duruma girişi engeller veya bu durumdan çıkışı kolaylaştırır. K + iyon kanalları arasında korunan seçicilik filtresi imza dizisinin önemli bir parçası olan Glu71, kendisini transmembran voltaj alanı yönünde yeniden yönlendirme yeteneği voltaj geçitleme olayları için bir açıklama sağlayabildiğinden geçitlemede çok önemli bir rol oynar. KcsA'da. Amino asitlerin filtre bölgesindeki oryantasyonu, kararlı durum koşulları altında ökaryotlarda ve prokaryotlarda potasyum akışının modüle edilmesinde önemli fizyolojik rol oynayabilir.
Araştırma
İşlev
Potasyum kanal seçiciliğinin kesin mekanizması araştırılmaya ve tartışılmaya devam etmektedir ve seçiciliğin farklı yönlerini tanımlamak için birden fazla model kullanılmaktadır. George Eisenman tarafından Coulomb yasasına dayalı olarak geliştirilen alan kuvveti kavramına dayalı seçiciliği açıklayan modeller KcsA'ya uygulanmıştır. KcsA'nın seçiciliği için alternatif bir açıklama, Francisco Bezanilla ve Armstrong tarafından geliştirilen yakın uyum modeline (aynı zamanda sıkı oturma modeli olarak da bilinir) dayanmaktadır . Ana zincir seçicilik filtresi oluşturan karbonil oksijen atomları içinde su moleküllerinin yerini sağlar kesin bir pozisyonda tutulur hidratlı kabuk arasında potasyum iyonu, ancak çok uzak mesafede olan sodyum iyonu. Daha fazla çalışma, iyon bağlama, topolojik hususlar ve sürekli iyon bağlama bölgelerinin sayısındaki termodinamik farklılıkları inceledi.
Ek olarak, kristal yapı çalışmasının ve simülasyonlarının önemli bir sınırlaması henüz tartışılmamıştır: KcsA'nın en iyi çözümlenmiş ve en çok uygulanan kristal yapısı, kanalın 'kapalı' formu gibi görünmektedir. Kanalın kapalı durumu , kristal yapının X-ışını kristalografisi ile çözüldüğü nötr pH'da tercih edildiğinden, bu mantıklıdır . Bununla birlikte, KcsA'nın dinamik davranışı, bir kristal yapı kaçınılmaz olarak bir kanalın statik, uzamsal ve zamansal olarak ortalama bir görüntüsünü sağladığı için kanalın analizini zorlaştırır. Moleküler yapı ile fizyolojik davranış arasındaki boşluğu kapatmak için potasyum kanallarının atomik çözünürlük dinamiklerini anlamak gerekir.
Uygulamalar
KcsA'nın gözenek ve diğer ökaryotik K + iyon kanalı proteinleri arasındaki yüksek dizi benzerliğinden dolayı KcsA, drosophilla'dan türetilen Shaker ve insan hERG potasyum kanalı gibi diğer önemli voltaj ileten proteinlerin davranışı hakkında önemli bilgiler sağlamıştır . KcsA, hERG ve çeşitli ilaç bileşikleri arasındaki etkileşimleri modellemek için mutajenez çalışmalarında kullanılmıştır . Bu tür testler, edinilmiş uzun QT sendromuna neden olan ilaç-hERG kanal etkileşimlerini tarayabilir , yeni ilaçların kardiyak güvenliğini belirlemek için gereklidir . Ek olarak, hERG kardiyak K + kanalının çok durumlu bir temsilini oluşturmak için kapalı durum KcsA kristal yapısına dayalı homoloji modelleri hesaplamalı olarak oluşturulmuştur . Bu tür modeller, hERG kanalının esnekliğini ortaya çıkarır ve bir dizi farklı iyon kanalı etkileşimli ligandın bağlanma afinitesini tutarlı bir şekilde tahmin edebilir. Karmaşık ligand-hERG yapılarının analizi, ilaç yapısı ve yerleştirme potansiyeline dayalı olarak azaltılmış hERG sorumluluğuna sahip ilaç analoglarının sentezine rehberlik etmek için kullanılabilir.