Klorofil floresansı - Chlorophyll fluorescence

Beyaz ışık (yukarıda) ve UV ışığı indükleyen floresan (aşağıda) altında gösterilen alkol içindeki bir klorofil özütü.

Plagiomnium undulatum'dan bir yosun yaprağının mikroskobik görüntüleri . Üstte parlak alan mikroskopisi ve altta floresan mikroskobu . Kırmızı floresan, kloroplastlardaki klorofilden gelir.

Klorofil floresansı , uyarılmış durumdan uyarılmamış duruma dönüş sırasında klorofil molekülleri tarafından yeniden yayılan ışıktır . Bitkilerde , alglerde ve bakterilerde fotosentetik enerji dönüşümünün bir göstergesi olarak kullanılır . Uyarılmış klorofil, fotosentezi (fotokimyasal enerji dönüşümü), fotokimyasal olmayan söndürmede ısı olarak veya floresan radyasyonu olarak emisyon yoluyla emilen ışık enerjisini dağıtır . Bu süreçler birbirini tamamlayan süreçler olduğundan, klorofil floresansının analizi, geniş bir uygulama yelpazesi ile bitki araştırmalarında önemli bir araçtır.

Kautsky etkisi

Karanlığa adapte olmuş bir yaprağın aydınlatılması üzerine, Fotosistem II'den (PSII) flüoresansta hızlı bir artış olur ve bunu yavaş bir düşüş izler. İlk olarak Kautsky ve diğerleri, 1932 tarafından gözlemlenen buna Kautsky Etkisi denir. Klorofil floresan artışındaki bu değişken artış, fotosistem II'den kaynaklanmaktadır. Fotosistem I'den gelen floresan değişken değil, sabittir.

Floresandaki artış, PSII reaksiyon merkezlerinin "kapalı" veya kimyasal olarak indirgenmiş durumda olmasından kaynaklanmaktadır . Daha fazla elektron kabul edemediğinde reaksiyon merkezleri "kapalı". Bu , PSII'nin aşağısındaki elektron alıcıları elektronlarını bir sonraki elektron taşıyıcısına henüz geçirmediğinde ve bu nedenle başka bir elektronu kabul edemediğinde meydana gelir. Kapalı reaksiyon merkezleri, genel fotokimyasal verimliliği azaltır ve böylece floresan seviyesini artırır. Bir yaprağı karanlıktan aydınlığa aktarmak, kapalı PSII reaksiyon merkezlerinin oranını arttırır, bu nedenle floresan seviyeleri 1-2 saniye artar. Ardından, floresans birkaç dakika içinde azalır. Bunun nedeni; 1. karbon fiksasyonunda yer alan enzimler nedeniyle elektronların PSII'den uzağa taşındığı daha fazla "fotokimyasal söndürme"; ve 2. daha fazla enerjinin ısıya dönüştürüldüğü daha fazla "fotokimyasal olmayan söndürme".

floresan ölçümü

Genellikle ilk ölçüm, minimum floresan seviyesidir, . Bu, fotosentetik ışığın yokluğundaki floresandır. ${\görüntüleme stili \,F_{0}}$

Fotosentezi analiz etmek için klorofil floresan ölçümlerini kullanmak için, araştırmacılar fotokimyasal söndürme ile fotokimyasal olmayan söndürme (ısı dağılımı) arasında ayrım yapmalıdır . Bu, araştırmacıların yalnızca fotokimyasal olmayan söndürme varlığında floresansı ölçmesine olanak tanıyan fotokimyayı durdurarak elde edilir. Fotokimyasal söndürmeyi ihmal edilebilir seviyelere indirmek için, yaprağa yüksek yoğunluklu, kısa bir ışık flaşı uygulanır. Bu, tüm PSII reaksiyon merkezlerini geçici olarak kapatır, bu da PSII'nin enerjisinin aşağı akım elektron taşıyıcılarına geçmesini önler. Flaş kısa ise fotokimyasal olmayan söndürme etkilenmeyecektir. Flaş sırasında floresan, maksimum floresan olarak bilinen herhangi bir fotokimyasal söndürmenin yokluğunda ulaşılan seviyeye ulaşır . ${\displaystyle \,F_{m}}$

Fotokimyasal söndürmenin etkinliği (PSII'nin etkinliğinin bir temsilcisidir) , ışıkta sabit flüoresan verimi ve fotosentetik ışığın yokluğunda flüoresans verimi karşılaştırılarak tahmin edilebilir . Fotokimyasal olmayan söndürmenin verimliliği, çeşitli iç ve dış faktörler tarafından değiştirilir. Isı dağılımındaki değişiklikler, . Isı yayılımı tamamen durdurulamaz, bu nedenle fotokimyasal olmayan söndürmenin yokluğunda klorofil floresan verimi ölçülemez. Bu nedenle, araştırmacılar, fotokimyasal olmayan söndürme tahminlerini karşılaştırmak için karanlığa uyarlanmış bir nokta ( ) kullanırlar. ${\displaystyle \,F_{m}}$${\görüntüleme stili \,F_{t}}$${\görüntüleme stili \,F_{0}}$${\displaystyle \,F_{m}}$${\displaystyle F_{m}^{0}}$

Ortak floresan parametreleri

${\görüntüleme stili \,F_{0}}$: Minimal floresan (keyfi birimler). Fotosistem II'nin tüm reaksiyon merkezleri açıkken karanlığa uyarlanmış örneğin floresan seviyesi.

${\displaystyle \,F_{m}}$: Maksimal floresan (keyfi birimler). Yüksek yoğunluklu bir darbe uygulandığında karanlığa uyarlanmış örneğin floresan seviyesi. Fotosistem II'nin tüm reaksiyon merkezleri kapalıdır.

${\displaystyle \,{F_{0}}'}$: Minimal floresan (keyfi birimler). Fotosistem II'nin tüm reaksiyon merkezleri açıkken ışığa uyarlanmış örneğin floresan seviyesi; fotokimyasal olmayan söndürme ile göre düşürülür . ${\görüntüleme stili \,F_{0}}$

${\displaystyle \,{F_{m}}'}$: Maksimal floresan (keyfi birimler). Yüksek yoğunluklu bir darbe uygulandığında ışığa uyarlanmış örneğin floresan seviyesi. Fotosistem II'nin tüm reaksiyon merkezleri kapalıdır.

${\görüntüleme stili \,F_{t}}$: Kararlı durum terminal floresansı (keyfi birimler). Fotokimyasal ve fotokimyasal olmayan işlemlerle kararlı durum floresan seviyesi azaldı (= söndürüldü).

${\görüntüleme stili \,T_{1/2}}$: Yarım gelen yükselme zamanı için . ${\görüntüleme stili \,F_{0}}$${\displaystyle \,F_{m}}$

Hesaplanan parametreler

${\displaystyle \,F_{v}}$değişken floresandır. = - olarak hesaplanır . ${\displaystyle \,F_{v}}$${\displaystyle \,F_{m}}$${\görüntüleme stili \,F_{0}}$

${\displaystyle {\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}}$değişken flüoresansın maksimum flüoresansa oranıdır. olarak hesaplanmıştır . Bu, PSII'nin maksimum verimliliğinin bir ölçüsüdür (tüm PSII merkezlerinin açık olması durumundaki verimlilik). karanlığa uyarlanmış ölçümler alarak PSII'nin potansiyel verimliliğini tahmin etmek için kullanılabilir. ${\displaystyle {\frac {F_{m}-F_{0}}{F_{m}}}}$${\displaystyle {\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}}$

${\ Displaystyle \,\Phi _{PSII}}$Fotosistem II'nin etkinliğini ölçer. = olarak hesaplanır . Bu parametre, fotokimyada kullanılan PSII tarafından emilen ışığın oranını ölçer. Bu nedenle, lineer elektron taşıma hızının bir ölçüsünü verebilir ve böylece genel fotosentezi gösterir. ${\görüntüleme stili \,Y_{(II)}}$${\displaystyle ,{\frac {{F_{m}}'-F_{t}}{{F_{m}}'}}}$

${\görüntüleme stili \,qP}$(fotokimyasal söndürme). olarak hesaplanmıştır . Bu parametre, açık olan PSII reaksiyon merkezlerinin oranına yaklaşır. ${\displaystyle \,{\frac {{F_{m}}'-F_{t}}{{F_{m}}'-{F_{0}}'}}}$

Verimlilik hakkında bir tahminde bulunun ve bize verimliliği değiştiren süreçlerin hangileri olduğunu söyleyin. Yüksek yoğunluklu bir ışık sonucunda reaksiyon merkezlerinin kapanması değerini değiştirecektir . Fotokimyasal olmayan söndürmenin verimliliğindeki değişiklikler oranı değiştirecektir . ${\ Displaystyle \,\Phi _{PSII}}$${\görüntüleme stili \,qP}$${\displaystyle {\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}}$${\görüntüleme stili \,qP}$${\displaystyle {\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}}$

Teorinin Uygulamaları

Bir fotosentez ölçüsü olarak PSII verimi

Klorofil floresansı, fotosentezin bir ölçüsü gibi görünmektedir, ancak bu, aşırı basitleştirmedir. Floresan, ışık yoğunluğu ile çarpılarak lineer elektron taşıma oranını tahmin etmek için kullanılabilen PSII fotokimyasının verimliliğini ölçebilir. Bununla birlikte, araştırmacılar fotosentezden söz ederken genellikle karbon fiksasyonu anlamına gelir . Elektron transferi ve CO ₂ sabitleme iyi bir korelasyon, ama böyle fotorespirasyon, nitrojen metabolizması gibi işlemlere alanında ilişkili olmayabilir olabilir Mehler reaksiyonu .

Elektron taşınmasını karbon fiksasyonuyla ilişkilendirme

Güçlü bir araştırma tekniği, bitkilerin çevrelerine verdiği tepkinin tam bir resmini elde etmek için klorofil floresansını ve gaz değişimini aynı anda ölçmektir . Bu tekniklerden biri, aynı zamanda CO ölçmektir ₂ -olmayan photorespiratory koşullarda, farklı ışık yoğunluklarda fiksasyonu ve PSII fotokimya. CO Bir arsa ₂ fiksasyon ve PSII fotokimyada molekül CO başına elektron ihtiyacını belirten ₂ sabit. Bu tahminden, fotorespirasyonun kapsamı tahmin edilebilir. Bu, kuraklık sırasında foto-koruyucu bir mekanizma olarak fotorespirasyonun önemini araştırmak için kullanılmıştır.

Düşük ve yüksek sıcaklıkların etkilerini anlamak için floresan analizi de uygulanabilir.

• Sobrado (2008) , öncü türlerin ve orman türlerinin yüksek yoğunluklu ışığa gaz değişimi ve klorofil ve floresan tepkilerini araştırdı . Öğlen yaprak gaz alışverişi kullanılarak ölçülmüştür fotosentez sistemi , net fotosentez oranım, gs, ve hücreler arası CO ölçülen ₂ konsantrasyonunu ( ). Gaz değişimi ölçümleri için kullanılan aynı yapraklarda, klorofil a floresan parametreleri (başlangıç, ; maksimum, ; ve değişken, ) bir florometre kullanılarak ölçüldü. Sonuçlar, farklı habitatları işgal eden öncü türlere ve orman türlerine rağmen, her ikisinin de güneşe maruz kalan yapraklarda gün ortası fotoinhibisyonuna karşı benzer kırılganlık gösterdiğini gösterdi.${\görüntüleme stili C_{i}}$${\görüntüleme stili \,F_{0}}$${\displaystyle \,F_{m}}$${\displaystyle \,F_{v}}$

Stres ve stres toleransının ölçülmesi

Klorofil floresansı çoğu bitki stresini ölçebilir . Klorofil floresansı bitki stresinin bir temsilcisi olarak kullanılabilir çünkü çevresel stresler, örneğin aşırı sıcaklık, ışık ve su mevcudiyeti, bir bitkinin normal olarak metabolize olma yeteneğini azaltabilir. Bu, ışık enerjisinin klorofil tarafından emilmesi ile fotosentezde enerji kullanımı arasında bir dengesizlik anlamına gelebilir.

• Favaretto et al. (2010), %100 ve %10 ışık altında yetiştirilen öncü ve geç ardıl türlerde güçlü bir ışık ortamına adaptasyonu araştırdı. Klorofil ve floresans dahil çok sayıda parametre ölçüldü. Geç ardıl türlerde, tam güneş ışığı altında öncü türlere göre daha büyük bir düşüş gözlendi. Genel olarak, sonuçları öncü türlerin yüksek güneş ışığı altında geç kalan türlere göre daha iyi performans gösterdiğini ve öncü bitkilerin foto-oksidatif hasara karşı daha fazla potansiyel toleransa sahip olduğunu öne sürüyor.${\displaystyle {\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}}$

• NEOCLEOUS ve (2009) Vasilakakis tepkisini incelenmiştir ahududu için bor ve tuz stresi. , ve ' yi ölçmek için bir klorofil florometre kullanıldı . Yaprak klorofil floresansı, B konsantrasyonu düşük olduğunda NaCl konsantrasyonundan önemli ölçüde etkilenmedi. B arttırıldığında, tuzlu koşullar altında yaprak klorofil floresansı azaldı. B ve NaCl'nin ahududu üzerindeki birleşik etkisinin, fotokimyasal parametrelerde toksik bir etki oluşturduğu sonucuna varılabilir.${\görüntüleme stili \,F_{0}}$${\displaystyle \,F_{m}}$${\displaystyle \,F_{v}}$
• Lu ve Zhang (1999), buğday bitkilerinde ısı stresini incelediler ve su stresi altındaki yaprakların Fotosistem II'sindeki sıcaklık stabilitesinin, fotosentez sırasında metabolizmadaki dirençle pozitif olarak ilişkili olduğunu buldular.

Azot Dengesi İndeksi

Bitkilerin azot eksikliğini tespit etmek için klorofil ve flavonoller arasındaki oranı kullanan portatif bir multiparametrik florometre örneği

Yapraklardaki klorofil içeriği ile azot içeriği arasındaki bağlantı nedeniyle, bitkilerdeki azot eksikliğini çeşitli yöntemlerle tespit etmek için klorofil florometreleri kullanılabilir .

Birkaç yıllık araştırma ve deneylere dayanarak, polifenoller bir bitkinin nitrojen durumunun göstergeleri olabilir. Örneğin, bir bitki optimal koşullar altındayken, birincil metabolizmasını destekler ve klorofil ve birkaç flavonol (karbon bazlı ikincil bileşikler) içeren proteinleri (azot molekülleri) sentezler. Öte yandan, azot eksikliği durumunda, bitkinin flavonol üretiminin arttığını gözlemleyeceğiz.

Force-A'nın NBI (Azot Denge İndeksi), Klorofil ve Flavonoller (Azot/Karbon tahsisi ile ilgili) arasındaki oranı hesaplayarak bir kültürün nitrojen koşullarının değerlendirilmesine olanak tanır .

Klorofil İçeriğini Ölçün

Gitelson (1999), "735 nm'de klorofil floresansı ile 700 nm ila 710 nm dalga boyu aralığı, F735/F700 arasındaki oranın klorofil içeriği ile doğrusal orantılı olduğu bulundu (belirleme katsayısı, r2, 0,95'ten fazla) ve dolayısıyla bu oran, bitki yapraklarındaki klorofil içeriğinin kesin bir göstergesi olarak kullanılabilir."

Klorofil florometreler

Eksenel yaprak yüzeyinin floresan görüntüsü (Ft değeri)

Florometrelerin geliştirilmesi, klorofil floresan analizinin bitki araştırmalarında yaygın bir yöntem haline gelmesine izin verdi. Klorofil floresan analizi, Darbe-Genlik-Modülasyon (PAM) tekniğinin icadı ve ilk ticari modülasyonlu klorofil florometre PAM-101'in (Walz, Almanya) bulunmasıyla devrim yarattı. Ölçüm ışık huzmesini modüle ederek (mikrosaniye aralıklı darbeler) ve uyarılmış floresansın paralel tespiti ile, ortam ışığının varlığında bağıl floresan verimi (Ft) belirlenebilir. En önemlisi, bu, klorofil floresansının tam güneş ışığında bile sahada ölçülebileceği anlamına gelir.

Günümüzde klorofil florometreleri, birçok farklı bitki mekanizmasını ölçmek için tasarlanmıştır. Ölçüm protokolleri: F _V /F _M ve OJIP, Fotosistem II örneklerinin verimliliğini yaygın ve bilinen bir karanlık uyarlanmış durumda ölçer. Bu protokoller, birçok bitki stresi türünün ölçülmesinde faydalıdır. Bernard Genty'nin ışığa uyarlanmış ölçüm protokolü ΔF/F _M ' veya Y(II), ortam veya yapay aydınlatma koşulları altında bitki örneklerini ölçmenin etkili ve hassas bir yoludur. Bununla birlikte, Y(II) değerleri de ışık yoğunluğu ile değiştiğinden, ölçümün odak noktası ışık stresi olmadıkça, numuneler aynı ışık yoğunluğunda karşılaştırılmalıdır. Y(II), ısı stresi gibi bazı bitki stresi türlerine F _V /F _M'den daha duyarlı olabilir .

Diğer tesis mekanizması ölçüm protokolleri de geliştirilmiştir. Bir kloroplast ışığı emdiğinde, ışık enerjisinin bir kısmı fotokimyaya, bir kısmı düzenlenmiş ısı dağılımına ve bir kısmı da düzensiz ısı dağılımına gider. Tüm bu olayları ölçmek için çeşitli klorofil floresan ölçüm parametreleri mevcuttur. Göl modelinde, q _L fotokimyasal söndürmeyi ölçer, Y(NYO) tesis tarafından düzenlenen ısı dağılımını ölçer ve Y(NO) düzensiz ısı dağılımını ölçer. Su birikintisi modeli olarak adlandırılan daha eski bir söndürme protokolü, fotokimyasal söndürme için q _P , hem düzenlenmiş hem de düzenlenmemiş ısı dağılımının fotokimyasal olmayan söndürme için q _N ve fotokimyasal olmayan bir söndürme tahmini için NPQ kullanır. NPQ, göl modeline matematiksel olarak da yeniden canlandırıldı.

Buna ek olarak, parametreler q _E ve pNPQ fotokoruyucu ksantofil döngüsünü ölçmek için geliştirilmiştir. q _T durum geçişlerinin bir ölçüsüdür. q _M , kloroplast göçünün bir ölçüsüdür ve q _I , bitki fotoinhibisyonunun bir ölçüsüdür.

Daha düşük aktinik ışık seviyelerinde NPQ = qE+qT+qI

Yüksek aktinik ışık seviyelerinde NPQ = qE+qM=qI

Bazı florometreler, taşınabilir ve tek elle çalıştırılmak üzere tasarlanmıştır.

Görüntüleme florometrelerinde tutarlı bir şekilde daha fazla gelişme, numunelerin fotosentetik aktivitesinde uzamsal heterojenliklerin görselleştirilmesini kolaylaştırır. Bu heterojenlikler, örneğin büyüme, çeşitli çevresel stresler veya patojen enfeksiyonu sırasında bitki yapraklarında doğal olarak meydana gelir. Bu nedenle, örnek heterojenlikleri hakkında bilgi, bitki örneğinin fotosentetik performansının doğru yorumlanması için önemlidir. Yüksek performanslı görüntüleme florometre sistemleri, tek hücre/tek kloroplastın yanı sıra tüm yaprakları veya bitkileri kapsayan örnek alanları analiz etme seçenekleri sunar.

Alternatif yaklaşımlar

LIF sensörleri

Kautsky etkisine dayalı teknikler, klorofil floresansına dayalı çeşitli algılama ve değerlendirme yöntemlerini tüketmez. Özellikle, lazer kaynaklı floresan (LIF) alanındaki son gelişmeler, fotofizyolojik durum ve biyokütle değerlendirmeleri için yeterince kompakt ve verimli sensörler geliştirme fırsatı da sağlar. Bu tür sensörler, toplam flüoresans akısının gelişimini ölçmek yerine, nanosaniye süreli güçlü monokromatik lazer ışık darbeleriyle uyarılan bu akının spektral yoğunluğunu kaydeder. 15-20 dakikalık bir karanlığa adaptasyon süresi gerektirmeyen (Kautsky etkisi yöntemlerinde olduğu gibi) ve numuneyi önemli bir mesafeden harekete geçirebilen LIF sensörleri, hızlı ve uzaktan değerlendirme sağlayabilir.

• Mantar meşesi ( Quercus suber ) ve deniz çamında ( Pinus pinaster ) kuraklık stresinin değerlendirilmesinde klorofil emisyon oranı I ₆₈₅ / I ₇₄₀ temelinde LIF tekniğinin uygulanması Ref. Son zamanlarda LIF algılama tekniği, genetik olarak modifiye edilmiş Arabidopsis bitkileri kullanılarak kuraklık stresi sırasında fotosentetik metabolizmanın korunmasında pPLAIIa proteininin rolünü ele almak için kullanıldı.

• 2011 yılında Vieira ve ark. gelgit mikrofitobentos topluluklarını incelemek için kompakt, düşük maliyetli bir LIF sensörü (frekansı ikiye katlanmış katı hal Q-anahtarlı Nd:YAG lazer ve özel olarak modifiye edilmiş ticari minyatür fiber optik spektrometre Ocean Optics USB4000 etrafında inşa edilmiştir) uyguladı. Klorofil emisyonu, araştırmacıların yüzey biyokütlesini yeterince değerlendirmesini ve çamurlu çökeltilerdeki epipelik bentik mikroalglerin göç ritimlerini izlemesini sağladı.

Ayrıca bakınız

• Yaprakların gaz değişimi ve klorofil floresansı için entegre florometre
• Fotokimyasal olmayan söndürme
• Güneş kaynaklı floresan
• [1]

Gelişmiş Sürekli Uyarma Klorofil Florimetresi

Referanslar

Dış bağlantılar

• Lazar (1999). "Klorofil bir floresan indüksiyonu" . Biochimica ve Biophysica Açta (BBA) - Biyoenerjetik . 1412 (1): 1-28. doi : 10.1016/s0005-2728(99)00047-x . PMID  10354490 .
• Lazar (2006). "Polifazik klorofil, heyecan verici ışığın yüksek yoğunluğu altında ölçülen bir floresan yükselişi" . Fonksiyonel Bitki Biyolojisi . 33 : 9–30. doi : 10.1071/fp05095 .
• Lazar (2015). "Fotosentetik enerji bölme parametreleri" . Bitki Fizyolojisi Dergisi . 175 : 131-147. doi : 10.1016/j.jplph.2014.10.021 . PMID  25569797 .
• Kalaji; et al. (2012). "Bitkilerde ışık emisyonunun deneysel in vivo ölçümleri: David Walker'a adanmış bir bakış açısı". Fotosentez Araştırmaları . 114 (2): 69-96. doi : 10.1007/s11120-012-9780-3 . PMID  23065335 .
• Maxwell, K.; Johnson, GN (2000). "Klorofil floresansı - pratik bir kılavuz" . Deneysel Botanik Dergisi . 51 (345): 659-68. doi : 10.1093/jexbot/51.345.659 . PMID  10938857 .
• Murchie ve Lawson (2013). "Klorofil floresan analizi: iyi uygulama ve bazı yeni uygulamaları anlama kılavuzu" . Deneysel Botanik Dergisi . 64 (13): 3983-3998. doi : 10.1093/jxb/ert208 . PMID  23913954 .