Kanalrodopsin - Channelrhodopsin

Channelrhodopsins bir alt familyası olan retinylidene proteinler ( rhodopsins ) olarak işlev ışık-kapılı iyon kanallarının . Tek hücreli yeşil alglerde fototaksiyi kontrol eden duyusal fotoreseptörler olarak hizmet ederler : ışığa tepki olarak hareket. Diğer organizmaların hücrelerinde ifade edilirler, ışığın elektriksel uyarılabilirliği , hücre içi asitliği , kalsiyum akışını ve diğer hücresel süreçleri kontrol etmesini sağlarlar (bkz. optogenetik ). Model organizma Chlamydomonas reinhardtii'den Channelrhodopsin-1 (ChR1) ve Channelrhodopsin-2 (ChR2) , ilk keşfedilen channelrhodopsin'lerdir. Varyantlar diğer alg türlerinden klonlanmıştır ve daha fazlası beklenmektedir.

Yapı

Channelrhodopsin'in kristal yapısı. PDB 3ug9

Yapı açısından, kanalrodopsinler retiniliden proteinleridir . Bunlar , yedi-transmembran proteinleri gibi rodopsin ve ışık-izomerize içeren kromofor bütün- trans - retina (bir aldehit türevi ve vitamin A ). Retinal kromofor, protonlanmış bir Schiff bazı yoluyla proteinin geri kalanına kovalent olarak bağlıdır . Çoğu 7-transmembran proteini, ikinci haberciler aracılığıyla dolaylı olarak diğer iyon kanallarını açan G proteinine bağlı reseptörler iken (yani, metabotropiktirler ), kanalrodopsinler doğrudan iyon kanallarını oluştururlar (yani, iyonotropiktirler ). Bu, hücresel depolarizasyonu son derece hızlı, sağlam ve fotostimülasyon dahil olmak üzere biyomühendislik ve sinirbilim uygulamaları için kullanışlı hale getirir .

İşlev

ChR2-RFP füzyon yapısının şeması

Doğal ("vahşi tip") ChR2, maksimum 480 nm'de bir absorpsiyon ve etki spektrumu ile mavi ışığı emer . Bütün-zaman trans -retinal kompleks emmekte bir foton , bu bütün-bir yapı değişikliklerini oluşturmaktadır trans- 13- cis retinal. Bu değişiklik, zar-ötesi proteinde, gözeneği en az 6 A'ya açarak bir tane daha ekler. Milisaniyeler içinde retina gevşeyerek all-trans formuna geri döner, gözenekleri kapatır ve iyon akışını durdurur. Çoğu doğal kanalrodopsin, H + , Na + , K + ve Ca 2+ iyonlarını ileten spesifik olmayan katyon kanallarıdır . Son zamanlarda, anyon ileten kanalrodopsinler keşfedilmiştir.

Tasarımcı-channelrhodopsins

Channelrhodopsins kilit araçlardır optogenetics . C-terminali channelrhodopsin-2 uç hücre içi alanı içine uzanır ve ile ikame edilmiş olabilir floresan proteinleri kanal işlevini etkilemeden. Bu tür bir füzyon yapısı , ChR2 eksprese eden hücrelerin morfolojisini görselleştirmek için faydalı olabilir. Retina bağlama cebine yakın nokta mutasyonlarının , çeşitli farklı araçlarla sonuçlanan, channelrhodopsinin biyofiziksel özelliklerini etkilediği gösterilmiştir.

kinetik

Optik aktivasyondan sonra kanalın kapanması, protein kalıntıları C128 veya D156'nın mutasyona uğratılmasıyla büyük ölçüde geciktirilebilir. Bu modifikasyon, mavi ışık darbesiyle açılabilen ve yeşil veya sarı ışık darbesiyle kapatılabilen süper hassas kanalrodopsinlerle sonuçlanır (Adım işlevli opsinler). E123 tortusunun mutasyona uğratılması, kanal kinetiğini (ChETA) hızlandırır ve ortaya çıkan ChR2 mutantları, nöronları 200 Hz'e kadar hızlandırmak için kullanılmıştır. Genel olarak, yavaş kinetiklere sahip kanalrodopsinler, düşük ışık seviyelerinde bile açık kanallar zamanla biriktiğinden, popülasyon seviyesinde ışığa daha duyarlıdır.

fotoakım genliği

H134R ve T159C mutantları, artan fotoakımlar sergiler ve T159 ve E123 (ET/TC) kombinasyonu, vahşi tip ChR2'den biraz daha büyük fotoakımlara ve biraz daha hızlı kinetiklere sahiptir. ChR varyantları arasında, ChR1 ve ChR2'nin bir kimera ve nokta mutantı olan ChIEF, en büyük fotoakımları ve en az duyarsızlaştırmayı gösterir ve vahşi tip ChR2'ye benzer kinetiklere sahiptir.

dalga boyu

Kimerik kanalrodopsinler, ChR1 ve VChR1'den gelen zar ötesi sarmalların birleştirilmesiyle geliştirilmiştir, bu da kırmızı spektral kaymalarla (C1V1 ve ReaChR gibi) ChR'lerin geliştirilmesine yol açar. ReaChR, memeli hücrelerinde membran kaçakçılığını ve güçlü ekspresyonu iyileştirdi ve beyin sapı motor nöronlarının minimal invaziv, transkraniyal aktivasyonu için kullanıldı . Diğer organizmalardaki homolog diziler için yapılan aramalar, spektral olarak geliştirilmiş ve daha güçlü kırmızıya kaydırılmış kanalrodpsinler (Chrimson) vermiştir. ChR2 ile kombinasyon halinde, bu sarı/kırmızı ışığa duyarlı channelrhodopsinler, farklı renklerde ışık darbeleriyle iki nöron popülasyonunun bağımsız olarak kontrol edilmesini sağlar.

Mavi-kaydırılmış channelrhodopsin yosun içinde keşfedilmiştir Scherffelia Dubia . Membran trafiğini ve hızını iyileştirmek için bazı mühendisliklerden sonra, ortaya çıkan araç (CheRiff), 460 nm uyarmada büyük fotoakımlar üretti. OptoCaMP adı verilen tamamen optik bir sistemde Genetik Olarak Kodlanmış Kalsiyum Göstergesi jRCaMP1b ile birleştirilmiştir.

iyon seçiciliği

Çoğu channelrhodopsin, spesifik olmayan katyon kanallarıdır. Nöronlarda ifade edildiklerinde, çoğunlukla Na + iyonlarını iletirler ve bu nedenle depolarize olurlar . L132C mutasyonu (CatCh), kalsiyum için geçirgenliği artırır. İlk K + 'e özgü channelrhodopsin geçenlerde bir mantar benzeri keşfedildi protistlerin .

E90'ın pozitif yüklü amino asit arginine mutasyona uğraması, kanalrodopsini spesifik olmayan bir katyon kanalından klorür ileten bir kanala (ChloC) dönüştürür. Cl- için seçicilik, kanal gözenekindeki negatif yüklü artıkların değiştirilmesiyle daha da iyileştirildi, bu da ters çevirme potansiyelini daha negatif hale getirdi . Anyon ileten channelrhodopsinler (iChloC, iC++, Gt ACR), mavi ışıkla aydınlatıldıklarında hücre kültüründe ve bozulmamış hayvanlarda nöronal sıçramayı engeller.

Uygulamalar

Kanalrodopsinler, çeşitli transfeksiyon teknikleri (viral transfeksiyon , elektroporasyon , gen tabancası ) veya transjenik hayvanlar kullanılarak nöronlar gibi uyarılabilir hücrelerde kolaylıkla eksprese edilebilir . Işık emici retina pigmenti ( omurgalıların ) çoğu hücresinde A Vitamini olarak bulunur , bu da nöronları herhangi bir kimyasal bileşik eklemeden fotostimüle etmeyi mümkün kılar . Kanalrodopsinlerin keşfinden önce, sinirbilimciler beyindeki nöronların aktivitesini kaydetmek ve bu aktiviteyi davranışla ilişkilendirmekle sınırlıydı . Bu, kaydedilen nöral aktivitenin aslında bu davranışa neden olduğunu kanıtlamak için yeterli değildir . Optogenetik olarak bilinen yeni ortaya çıkan bir alan olan ışıkla genetiği değiştirilmiş hücrelerin ağlarını kontrol etmek, araştırmacıların artık belirli bir nöron grubundaki aktivite ile örneğin karar verme gibi zihinsel olaylar arasındaki nedensel bağlantıyı keşfetmelerine olanak tanıyor . Nematodlar, meyve sinekleri, zebra balığı ve farelerde davranışın optik kontrolü gösterilmiştir. Son zamanlarda, klorür ileten channelrhodopsinler geliştirildi ve doğada da bulundu. Bu araçlar, hücre kültüründe ve canlı hayvanlarda şant inhibisyonu yoluyla nöronları susturmak için kullanılabilir .

Birden fazla ışık rengi kullanmak, optogenetik deneylerin olanaklarını genişletir . Mavi ışığa duyarlı ChR2 ve sarı ışıkla aktive olan klorür pompası halorhodopsin birlikte çok renkli optik aktivasyonu ve nöral aktivitenin susturulmasını sağlar. Koloni alg Volvox carteri'den gelen VChR1 , 535 nm'de maksimum absorbe eder ve VChR1 tarafından üretilen fotoakımlar tipik olarak çok küçük olmasına rağmen sarı ışık (580 nm) ile hücreleri uyarmak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, VChR1-ChR2 hibritleri , 560 nm'de maksimum uyarım ve 600 nm'nin üzerindeki dalga boylarında %50 pik absorbans sergileyen yönlendirilmiş evrim kullanılarak geliştirilmiştir .

Floresan etiketli ChR2 kullanılarak, ışıkla uyarılan aksonlar ve sinapslar tanımlanabilir. Bu, sinaptik plastisitenin uyarılması sırasında moleküler olayları incelemek için yararlıdır . Transfekte edilmiş kültürlenmiş nöronal ağlar , robotik ve kontroldeki uygulamalar için istenen bazı davranışları gerçekleştirmek için uyarılabilir. ChR2 ayrıca beynin bir tarafından diğerine uzun menzilli bağlantıları haritalamak ve bireysel nöronların dendritik ağacındaki girdilerin uzaysal konumunu haritalamak için kullanılmıştır.

Nöronlar ChR ifadesini uzun süre tolere edebilir ve birçok laboratuvar tıbbi ihtiyaçları çözmek için optogenetik stimülasyonu test ediyor. Kör farelerde, iç retina hücrelerinde ChR2 eksprese edilerek görsel fonksiyon kısmen restore edilebilir. 2021'de, kırmızı ışığa duyarlı ChR ChrimsonR, retinal dejenerasyondan ( Retinitis pigmentosa ) muzdarip bir insan hastanın gözlerine viral olarak verildi ve bu, vizyonunun kısmen iyileşmesine yol açtı. Optik koklear implantların hayvan deneylerinde iyi çalıştığı gösterilmiştir ve şu anda klinik deneylerden geçmektedir. Gelecekte, chrs için örneğin daha tıbbi uygulamalar bulabilir derin beyin uyarımı ve Parkinson hastalarında veya bazı formlarını kontrol etmek Epilepsi .

Tarih

Mikroalglerin motilitesi ve fotooryantasyonu ( fototaksi ) dünya çapında birçok laboratuvarda yüz yıldan fazla bir süredir incelenmiştir.

1980'de Ken Foster, alg gözlerinin işlevselliği hakkında ilk tutarlı teoriyi geliştirdi. Ayrıca yayınlanmış eylem spektrumlarını ve kör hücreleri retina ve retina analogları ile tamamlayarak, Chlorophyceae'deki hareketlilik tepkileri için fotoreseptörün rodopsin olduğu sonucuna varmıştır .

Chlorophyceae Heamatococcus pluvialis ve Chlamydomonas reinhardtii'nin fotoakımları, Oleg Sineshchekov ve Peter Hegemann gruplarında uzun yıllar çalışıldı ve 1978 ve 1991 yıllarında iki çığır açıcı yayınla sonuçlandı. fotoreseptör akımlarının ve müteakip kamçı hareketlerinin rodopsin ve kontrol fototaksisi ve fotofobik tepkilerin aracılık ettiği belirlendi. Kısa bir ışık parlamasından sonra fotoreseptör akımının aşırı hızlı yükselmesi, rodopsin ve kanalın bir protein kompleksinde, hatta tek bir protein içinde yakından bağlantılı olduğu sonucuna yol açtı.

Bununla birlikte, rodopsin-fotoreseptör(ler)in biyokimyasal saflaştırması uzun yıllar başarısız olmuştur.

Artık kanalrodopsinler ChR1 ve ChR2 olarak adlandırılan rodopsinlerin nükleotid dizileri, sonunda C. reinhardtii'deki büyük ölçekli bir EST dizileme projesinde ortaya çıkarıldı . Aynı dizilerinin bağımsız gönderme GenBank kendi adlandırma ile ilgili karışıklığa oluşturulan üç araştırma grubu tarafından: isimleri polis-3 ve polis-4 Hegemann grubu tarafından ilk sunulması için kullanılmıştır; Spudich'in grubu tarafından csoA ve csoB ; ve Takahashi'nin grubu tarafından akop-1 ve akop-2 . Georg Nagel , Ernst Bamberg, Peter Hegemann ve diğerleri tarafından her iki dizinin de bir Xenopus oositlerinde ve insan böbrek hücrelerinde (HEK) tek bileşenli ışıkla aktive olan katyon kanalları olarak işlev gördüğü bulundu .

"channelrhodopsin" adı bu olağandışı özelliği vurgulamak için icat edildi ve diziler buna göre yeniden adlandırıldı. Bu arada, alg hücrelerinde fotoreseptör akımlarının üretilmesindeki rolleri Oleg Sineshchekov, Kwang-Hwan Jung ve John Spudich ve Peter Berthold ve Peter Hegemann tarafından karakterize edildi.

Kasım 2004'te, Zhuo-Hua Pan bir kağıt gönderilmektedir Doğa channelrhodopsin ile transfekte kör farelerde görme restorasyon raporlama, ancak kağıt reddedildi ve sonuçta yayınlanan Neuron 2006 yılında.

Bu arada, 2005 yılında, üç grup sırayla ChR2'yi nöronların , nöral devrelerin ve davranışların genetik olarak hedeflenmiş optik uzaktan kontrolü ( optogenetik ) için bir araç olarak kurdu .

İlk başta, Karl Deisseroth'un laboratuvarı (Ağustos 2005'te yayınlanan bir makalede) , ChR2'nin memeli nöronlarını in vitro kontrol etmek için konuşlandırılabileceğini ve milisaniyeler düzeyinde zamansal kesinlik elde edebileceğini gösterdi (hem spiking gecikmesi açısından hem de zamansal titreme). Bu önemli bir bulguydu, çünkü ilk olarak, tüm opsinler (mikrobik ve omurgalı) ışık algılayıcı ko-faktör olarak retinaya ihtiyaç duyar ve merkezi memeli sinir hücrelerinin yeterli retinal seviyeleri içerip içermeyeceği belli değildi, ama yapıyorlar; ikincisi, küçük tek kanallı iletkenliğe rağmen, memeli nöronlarını aksiyon potansiyeli eşiğinin üzerine çıkarmak için yeterli gücü gösterdi; ve üçüncüsü, channelrhodopsin'in, nöronların çalıştığı zamansal hassasiyetle (milisaniyeler) nöral aktivitenin kontrol edilebildiği ilk optogenetik araç olduğunu gösterdi. Fotostimülasyon için daha önceki bir araç olan cHARGe, kültürlü nöronlarda prensip kanıtı gösterdi, ancak saniyeler mertebesinde bir hassasiyetle çalıştığı, oldukça değişken olduğu ve bireysel aksiyon potansiyellerinin kontrolüne izin vermediği için diğer gruplar tarafından asla kullanılmadı .

Daha sonra Peter Hegemann ve Stefan Herlitze'nin grupları tarafından ChR2'nin şu anda civciv omuriliğinde omurgalı nöronlarının aktivitesini kontrol etme yeteneğini doğrulayan ikinci bir çalışma yayınlandı . Bu çalışma, ChR2'nin bir optik susturucu, bu durumda omurgalı rhodopsin -4 ile birlikte ifade edildiği ilk çalışmaydı ve ilk kez, uyarılabilir hücrelerin bu iki araç kullanılarak aynı anda etkinleştirilip susturulabileceğini ve dokuyu farklı dalga boylarında aydınlatabileceğini gösterdi.

Grupları Alexander Gottschalk ve Ernst Bamberg spesifik nöronlarda veya kas hücrelerinde ifade edilmesi halinde CHR2, öngörülebilir davranışları uyandırabilir örneğin, bu durumda, bir hayvanda sinir sistemi kontrol edebilirler (Georg Nagel deneysel öne alarak) omurgasız C. elegans . Bu, bir optogenetik deneyde bir hayvanın davranışını yönlendirmek için ChR2'yi kullanan ve genetik olarak belirlenmiş bir hücre tipini optik uzaktan kumandaya tabi kılan ilk kişiydi. Her iki yön de o yılın başlarında başka bir grup, Miesenböck laboratuvarı tarafından dolaylı olarak ışık kapılı iyon kanalı P2X2'yi konuşlandırmış olsa da, bundan böyle, uyarılabilir hücrelerin genetik olarak hedeflenmiş uzaktan kontrolü alanına hakim olan kanalrodopsin gibi mikrobiyal opsinlerdi. güç, hız, hedeflenebilirlik, kullanım kolaylığı ve doğrudan optik aktivasyonun geçici kesinliği, kafesli ligandlar gibi herhangi bir harici kimyasal bileşik gerektirmez.

Başlıca dezavantajlarının üstesinden gelmek için - küçük tek kanallı iletkenlik (özellikle sabit durumda), bir optimal uyarma dalga boyunun (~ 470 nm, mavi) sınırlandırılmasının yanı sıra nispeten uzun iyileşme süresi, yukarıdaki nöronların kontrollü ateşlenmesine izin vermez. 20–40 Hz — ChR2, genetik mühendisliği kullanılarak optimize edilmiştir . Bir nokta mutasyonu H134R (doğal proteinin 134 pozisyonundaki amino asit Histidin'in bir Arginin ile değiştirilmesi), ChR2'yi C. elegans'ta bir optogenetik araç olarak kuran 2005 tarihli bir makalede anlatıldığı gibi, kararlı durum iletkenliğinin artmasıyla sonuçlandı . 2009'da Roger Tsien'in laboratuvarı, ChR2'yi kararlı durum iletkenliğinde daha fazla artış için optimize etti ve ChR1 ve ChR2 kimeraları yaratarak ve spesifik amino asitleri mutasyona uğratarak, ChEF ve ChIEF'i üreterek, aksiyon potansiyeli trenlerinin sürülmesine izin vererek duyarsızlaştırmayı önemli ölçüde azalttı. 100 Hz'e kadar. 2010 yılında, Hegemann ve Deisseroth grupları, doğal ChR2'ye bir E123T mutasyonu soktu ve daha hızlı açık ve kapalı kinetiği olan ve 200 Hz'e kadar frekanslarda (uygun hücre tiplerinde) bireysel aksiyon potansiyellerinin kontrolüne izin veren ChETA'yı verdi.

Hegemann ve Deisseroth grupları ayrıca, C128S nokta mutasyonunun tanıtılmasının, elde edilen ChR2 türevini bir adım işlevli araç haline getirdiğini keşfetti: Bir kez mavi ışıkla "açıldığında", ChR2(C128S), değiştirilene kadar açık durumda kalır. sarı ışıkla kapalı – zamansal hassasiyeti bozan, ancak ışık hassasiyetini iki büyüklük mertebesi artıran bir değişiklik. Ayrıca çok hücreli alg Volvox carteri'de VChR1'i keşfettiler ve karakterize ettiler . VChR1, yalnızca küçük fotoakımlar üretir, ancak ChR2'ye göre kırmızıya kayan bir absorpsiyon spektrumu vardır. ChR1 dizisinin parçaları kullanılarak, fotoakım genliği daha sonra iki farklı dalga boyunda iki nöronal popülasyonun uyarılmasına izin verecek şekilde geliştirildi.

Deisseroth'un grubu, kemirgenlerde in vivo genetik olarak hedeflenmiş uzaktan kumanda, kemirgenlerde öğrenmenin optogenetik indüksiyonu, sıçanlarda Parkinson hastalığının deneysel tedavisi ve fMRI (opto-fMRI) ile kombinasyon gibi canlı hayvanlarda birçok uygulamaya öncülük etmiştir . Diğer laboratuvarlar tüm optik deneyler için kalsiyum görüntüleme ile ChR2 uyarma kombinasyonu öncülük etmiştir, bir transjenik yerin, uzun menzil ve lokal sinir devreleri, ChR2 ifade haritalama -, doğrudan veya Cre lox koşullu paradigma - hem de iki - ChR2'nin foton uyarımı, tek tek hücrelerin aktivasyonuna izin verir.

Mart 2013'te Beyin Ödülü (Grete Lundbeck Avrupa Beyin Araştırma Ödülü) Bamberg, Boyden, Deisseroth, Hegemann, Miesenböck ve Nagel'e "optogenetik buluşları ve iyileştirmeleri" için ortaklaşa verildi. Aynı yıl, Hegemann ve Nagel, "channelrhodopsin'in keşfi" için Louis-Jeantet Tıp Ödülü'nü aldı . 2015 yılında Boyden ve Deisseroth , Yaşam Bilimlerinde Atılım Ödülü'nü aldı ve 2020'de Miesenböck, Hegemann ve Nagel , optogenetiğin gelişimi için Yaşam Bilimi ve Tıp alanında Shaw ödülünü aldı .

Referanslar

daha fazla okuma

Dış bağlantılar