Güney lekesi - Southern blot

agaroz jel
En ağırlığın aşağı, kağıt havlu, aşağıdakilerden oluşan bir yığın Kaset membran bir nitroselüloz veya naylon , jel, tuz çözeltisi ve bir cam levha.
Hibridizasyon ve durulamadan sonra Southern blot membranı .
Ultraviyole aydınlatma altında Southern blot agaroz jeli .
Güney leke otoradyogramı .

Bir Güney benek olarak kullanılan bir yöntemdir , moleküler biyoloji , belirli saptanması için DNA dizisi DNA örneklerinde. Southern lekeleme, elektroforez ile ayrılmış DNA fragmanlarının bir filtre membranına transferini ve ardından prob hibridizasyonu ile fragman tespitini birleştirir .

Yöntem, adını ilk kez 1975'te yayınlayan İngiliz biyolog Edwin Southern'den almıştır. Benzer ilkeleri kullanan, ancak RNA veya protein kullanan diğer lekeleme yöntemleri (yani, batı lekesi , kuzey lekesi , doğu lekesi , güneybatı lekesi ) daha sonra olmuştur. Edwin Southern'in adına atıfta bulunularak adlandırılmıştır. Etiket isimsiz olduğundan, özel isimlerin geleneksel olduğu gibi, Southern büyük harfle yazılır . Diğer blotlama yöntemlerinin adları, benzetme yoluyla bu kuralı takip edebilir.

Yöntem

  1. Kısıtlama endonükleazları , yüksek moleküler ağırlıklı DNA ipliklerini daha küçük parçalara kesmek için kullanılır.
  2. DNA parçaları daha sonra boyutlarına göre ayırmak için bir agaroz jel üzerinde elektroforeze tabi tutulur .
  3. DNA fragmanlarından bazıları 15 kb'den büyükse , lekelemeden önce jel, seyreltik HC1 gibi bir asit ile işlenebilir . Bu , DNA parçalarını pürinasyondan arındırır , DNA'yı daha küçük parçalara ayırır , böylece jelden membrana daha verimli transfer sağlar.
  4. Alkali transfer yöntemleri kullanılıyorsa, DNA jeli, çift ​​sarmallı DNA'yı denatüre etmek için bir alkalin solüsyona (tipik olarak sodyum hidroksit içeren ) yerleştirilir . Alkali bir ortamda denatürasyon, DNA'nın negatif yüklü timin kalıntılarının pozitif yüklü bir membran amino gruplarına bağlanmasını iyileştirebilir, daha sonra proba hibridizasyon için tek DNA ipliklerine ayırabilir (aşağıya bakınız) ve herhangi bir kalıntı RNA'yı yok edebilir. hala DNA'da mevcut. Bununla birlikte, nötr transfer yöntemlerine göre alkalin seçimi genellikle ampiriktir ve eşdeğer sonuçlarla sonuçlanabilir.
  5. Jelin üzerine (veya transfer yönüne bağlı olarak altına ) bir nitroselüloz tabakası (veya alternatif olarak naylon ) membran yerleştirilir. Jel ile membran arasında iyi ve eşit bir temas sağlamak için jele eşit bir şekilde basınç uygulanır (ya emme kullanılarak ya da bir kağıt havlu yığını ve membran ve jelin üzerine bir ağırlık konularak). Emme yoluyla aktarım yapılıyorsa, jelin kurumasını önlemek ve sızdırmazlığı sağlamak için 20X SSC tamponu kullanılır. Yüksek su potansiyeli olan bir bölgeden düşük su potansiyeli olan bir bölgeye (genellikle filtre kağıdı ve kağıt dokular) kılcal etki ile tampon transferi daha sonra DNA'yı jelden zar üzerine taşımak için kullanılır; iyon değişimi etkileşimleri, DNA'nın negatif yükü ve zarın pozitif yükü nedeniyle DNA'yı zara bağlar.
  6. Membran daha sonra bir vakumda veya normal fırında 80 °C'de 2 saat (standart koşullar; nitroselüloz veya naylon membran) pişirilir veya aktarılan DNA'yı zara kalıcı olarak bağlamak için ultraviyole radyasyona (naylon zar) maruz bırakılır .
  7. Membran daha sonra bir hibridizasyon sondasına maruz bırakılır - hedef DNA'daki mevcudiyeti belirlenecek olan spesifik bir diziye sahip tek bir DNA parçası. Prob DNA'sı, genellikle radyoaktivite ekleyerek veya molekülü bir floresan veya kromojenik boya ile etiketleyerek tespit edilebilmesi için etiketlenir . Bazı durumlarda, hibridizasyon probu DNA'dan ziyade RNA'dan yapılabilir. Probun numune DNA'sına bağlanmasının özgüllüğünü sağlamak için, en yaygın hibridizasyon yöntemleri, membran yüzeyini bloke etmek için somon veya ringa balığı sperm DNA'sı ve spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için DNA, deiyonize formamid ve SDS gibi deterjanlar kullanır. sonda.
  8. Hibridizasyondan sonra, fazla prob membrandan yıkanır (tipik olarak SSC tamponu kullanılarak ) ve hibridizasyon modeli, radyoaktif veya flüoresan prob olması durumunda otoradyografi ile veya eğer varsa membran üzerinde renk gelişimi ile X-ışını filminde görselleştirilir. kromojenik bir tespit yöntemi kullanılır.

Sonuç

Sondanın filtre zarı üzerindeki belirli bir DNA parçasına hibridizasyonu, bu parçanın, sondayı tamamlayan DNA dizisi içerdiğini gösterir. DNA'nın elektroforez jelinden bir zara transfer aşaması, etiketli hibridizasyon probunun boyut fraksiyonlu DNA'ya kolayca bağlanmasına izin verir. Ayrıca, otoradyografi veya diğer tespit yöntemleriyle analiz için gerekli olan hedef prob hibritlerinin sabitlenmesine de olanak tanır . Restriksiyon enzimi ile sindirilmiş genomik DNA ile gerçekleştirilen Southern blot'lar, bir genomdaki dizilerin (örneğin, gen kopyalarının) sayısını belirlemek için kullanılabilir . Yalnızca kısıtlama enzimi tarafından kesilmemiş tek bir DNA parçasına hibritlenen bir prob, Southern blot üzerinde tek bir bant üretecekken, prob, oldukça benzer birkaç diziye hibritleştiğinde (örn. dizi çoğaltmanın sonucu olabilir). Hibridizasyon koşullarının modifikasyonu (örneğin, hibridizasyon sıcaklığının arttırılması veya tuz konsantrasyonunun düşürülmesi), spesifikliği arttırmak ve probun %100'den daha az benzer olan dizilere hibridizasyonunu azaltmak için kullanılabilir.

Uygulamalar

Southern blot transferi, hedef genin protein ürününün amino asit dizisi temelinde homolojiye dayalı klonlama için kullanılabilir. Oligonükleotitler , hedef diziye benzer olacak şekilde tasarlanmıştır. Oligonükleotitler kimyasal olarak sentezlenir, radyo-etiketlenir ve bir DNA kitaplığını veya klonlanmış DNA parçalarının diğer koleksiyonlarını taramak için kullanılır . Hibridizasyon probu ile hibritlenen sekanslar, örneğin hedeflenen genin tam uzunlukta sekansını elde etmek için ayrıca analiz edilir.

Southern lekeleme, belirli genlerde metillenmiş bölgeleri belirlemek için de kullanılabilir. Özellikle yararlı sınırlama nükleazlar olan MspI ve HpaII aynı dizi içindeki tanır ve klivaj, her ikisi de. Bununla birlikte, HpaII ise bu site içinde bir Cı-, metile gerektirir MspI kesen hem DNA bu sitede metillenmemiş. Bu nedenle, belirli bir prob ile analiz edilen bir dizi içindeki herhangi bir metillenmiş bölge, önceki enzim tarafından bölünecektir, ancak ikincisi tarafından bölünmeyecektir.

Ayrıca bakınız

Referanslar

  1. ^ "Güney Leke" .
  2. ^ Güney, Edwin Mellor (5 Kasım 1975). "Jel elektroforezi ile ayrılmış DNA parçaları arasında spesifik dizilerin saptanması". Moleküler Biyoloji Dergisi . 98 (3): 503–517. doi : 10.1016/S0022-2836(75)80083-0 . ISSN  0022-2836 . PMID  1195397 .
  3. ^ Çekmece; Stahelin, T; Gordon, J; et al. (1979). "Poliakrilamid jellerden nitroselüloz tabakalarına proteinlerin elektroforetik transferi: prosedür ve bazı uygulamalar" . PNAS . 76 (9): 4350–4. Bibcode : 1979PNAS...76.4350T . doi : 10.1073/pnas.76.9.4350 . PMC  411572 . PMID  388439 .
  4. ^ Burnette, W. Neal (Nisan 1981). "Western Blotting: Proteinlerin Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jellerinden Modifiye Edilmemiş Nitroselüloza Elektroforetik Transferi ve Antikor ve Radyoiyodinli Protein A ile Radyografik Tespit". Analitik Biyokimya . 112 (2): 195–203. doi : 10.1016/0003-2697(81)90281-5 . ISSN  0003-2697 . PMID  6266278 .
  5. ^ Biochemistry 3. Baskı, Matthews, Van Holde ve diğerleri, Addison Wesley Publishing, sayfa 977

Dış bağlantılar

Southern blot hakkında kütüphane kaynakları