DNA dizilimi - DNA sequencing

DNA dizi belirleme işlemidir nükleik asit sekansı sırası - nükleotid içinde DNA . Dört bazın sırasını belirlemek için kullanılan herhangi bir yöntemi veya teknolojiyi içerir: adenin , guanin , sitozin ve timin . Hızlı DNA dizileme yöntemlerinin ortaya çıkışı, biyolojik ve tıbbi araştırma ve keşifleri büyük ölçüde hızlandırdı.

Bilgi DNA dizilerinin temel biyolojik araştırmalar için vazgeçilmez, ve bu şekilde çok sayıda uygulamalı alanlarda haline gelmiştir tıbbi tanı , biyoteknoloji , adli biyoloji , viroloji ve biyolojik sistematiği . Sağlıklı ve mutasyona uğramış DNA dizilerinin karşılaştırılması, çeşitli kanserler dahil farklı hastalıkları teşhis edebilir, antikor repertuarını karakterize edebilir ve hasta tedavisine rehberlik etmek için kullanılabilir. DNA'yı sıralamak için hızlı bir yola sahip olmak, daha hızlı ve daha kişiselleştirilmiş tıbbi bakımın uygulanmasına ve daha fazla organizmanın tanımlanmasına ve kataloglanmasına olanak tanır.

Modern DNA dizileme teknolojisiyle elde edilen hızlı dizileme hızı , insan genomu ve birçok hayvan, bitki ve mikrobiyal DNA dizilerinin diğer tam DNA dizileri dahil olmak üzere çok sayıda tür ve yaşam türünden tam DNA dizilerinin veya genomlarının dizilenmesinde etkili olmuştur. Türler.

Otomatik zincir sonlandırma DNA dizilemesinin sonuçlarına bir örnek.

İlk DNA dizileri 1970'lerin başında akademik araştırmacılar tarafından iki boyutlu kromatografiye dayalı zahmetli yöntemler kullanılarak elde edildi . Bir DNA sıralayıcı ile floresan bazlı dizileme yöntemlerinin geliştirilmesinin ardından , DNA dizilimi kolaylaştı ve büyüklük sıraları daha hızlı hale geldi.

Uygulamalar

DNA dizilimi, bireysel genlerin , daha büyük genetik bölgelerin (yani gen kümeleri veya operonların ), tam kromozomların veya herhangi bir organizmanın tüm genomlarının dizisini belirlemek için kullanılabilir . DNA dizilimi aynı zamanda RNA veya proteinleri ( açık okuma çerçeveleri aracılığıyla) dolaylı olarak dizilemenin en etkili yoludur . Aslında, DNA dizilemesi biyolojinin ve tıp, adli tıp ve antropoloji gibi diğer bilimlerin birçok alanında kilit bir teknoloji haline geldi .

Moleküler Biyoloji

Dizileme, moleküler biyolojide genomları ve kodladıkları proteinleri incelemek için kullanılır . Sıralama kullanılarak elde edilen bilgiler, araştırmacıların genlerdeki değişiklikleri, hastalıklar ve fenotiplerle olan ilişkileri tanımlamasına ve potansiyel ilaç hedeflerini belirlemesine olanak tanır.

Evrimsel Biyoloji

DNA, bir nesilden diğerine geçiş açısından bilgilendirici bir makromolekül olduğundan, evrimsel biyolojide DNA dizilimi, farklı organizmaların nasıl ilişkili olduğunu ve nasıl evrimleştiklerini incelemek için kullanılır. Şubat 2021'de bilim adamları, ilk kez, bugüne kadar dizilenen en eski DNA olan bir milyon yıldan daha yaşlı bir mamut olan hayvan kalıntılarından DNA dizilimi yapıldığını bildirdiler .

metagenomik

Metagenomik alanı, bir su kütlesinde, kanalizasyonda , kirde, havadan filtrelenmiş kalıntılarda veya organizmalardan alınan sürüntü örneklerinde bulunan organizmaların tanımlanmasını içerir. Belirli bir ortamda hangi organizmaların bulunduğunu bilmek ekoloji , epidemiyoloji , mikrobiyoloji ve diğer alanlarda araştırma yapmak için çok önemlidir . Sıralama, araştırmacıların örneğin bir mikrobiyomda hangi tür mikropların bulunabileceğini belirlemesini sağlar .

Viroloji

Çoğu virüs, bir ışık mikroskobu tarafından görülemeyecek kadar küçük olduğundan, dizileme, virüsü tanımlamak ve incelemek için virolojideki ana araçlardan biridir. Viral genomlar DNA veya RNA'ya dayalı olabilir. RNA virüsleri, klinik örneklerde daha hızlı bozundukları için genom dizilimi için zamana karşı daha duyarlıdır. Geleneksel Sanger dizileme ve yeni nesil dizileme, temel ve klinik araştırmalarda virüsleri dizilemek için ve ayrıca ortaya çıkan viral enfeksiyonların teşhisi , viral patojenlerin moleküler epidemiyolojisi ve ilaca direnç testi için kullanılır. GenBank'ta 2,3 milyondan fazla benzersiz viral dizi bulunmaktadır . Son zamanlarda, NGS, viral genomlar oluşturmak için en popüler yaklaşım olarak geleneksel Sanger'ı geride bıraktı.

1990 kuş gribi salgını sırasında , viral dizileme, influenza alt tipinin bıldırcın ve kümes hayvanları arasındaki yeniden sınıflandırma yoluyla ortaya çıktığını belirledi . Bu, Hong Kong'da canlı bıldırcın ve kümes hayvanlarının pazarda birlikte satılmasını yasaklayan mevzuata yol açtı . Viral sıralama, moleküler saat tekniği kullanılarak bir viral salgının ne zaman başladığını tahmin etmek için de kullanılabilir .

İlaç

Tıp teknisyenleri, genetik hastalık riski olup olmadığını belirlemek için hastalardan alınan genleri (veya teorik olarak tam genomları) sıralayabilir. Bu bir tür genetik testtir , ancak bazı genetik testler DNA dizilimini içermeyebilir.

DNA dizilimi, nadir görülen hastalıkları teşhis etmek ve tedavi etmek için de giderek daha fazla kullanılmaktadır. Nadir genetik hastalıklara neden olan daha fazla gen tanımlandıkça, hastalar için moleküler teşhisler daha yaygın hale geliyor. DNA dizilimi, klinisyenlerin genetik hastalıkları tanımlamasına, hastalık yönetimini iyileştirmesine, üreme danışmanlığı sağlamasına ve daha etkili tedaviler sağlamasına olanak tanır.

Ayrıca, DNA dizilimi, daha kesin antibiyotik tedavilerine izin vermek için belirli bir bakteriyi belirlemek için yararlı olabilir , böylece bakteri popülasyonlarında antimikrobiyal direnç oluşturma riskini azaltır .

Adli soruşturma

DNA dizilimi, adli kimlik ve babalık testi için DNA profilleme yöntemleriyle birlikte kullanılabilir . DNA testi, son birkaç on yılda, bir DNA izini araştırılmakta olan şeye bağlamak için muazzam bir şekilde gelişti. Parmak izi, tükürük, saç folikülleri vb. DNA kalıpları, her canlı organizmayı diğerinden benzersiz bir şekilde ayırır. DNA testi, benzersiz ve bireyselleştirilmiş bir model üretmek için bir DNA zincirindeki spesifik genomları tespit edebilen bir tekniktir.

Dört kanonik baz

DNA'nın kanonik yapısı dört baza sahiptir: timin (T), adenin (A), sitozin (C) ve guanin (G). DNA dizilimi, bir DNA molekülündeki bu bazların fiziksel sırasının belirlenmesidir. Bununla birlikte, bir molekülde bulunabilecek birçok başka baz vardır. Bazı virüslerde (özellikle bakteriyofaj ), sitozin, hidroksi metil veya hidroksi metil glukoz sitozin ile değiştirilebilir. Memeli DNA'sında metil grupları veya fosfosülfat içeren varyant bazlar bulunabilir. Sıralama tekniğine bağlı olarak, belirli bir modifikasyon, örneğin insanlarda yaygın olan 5mC ( 5 metil sitozin ) saptanabilir veya saptanmayabilir.

Tarih

DNA yapısının ve fonksiyonunun keşfi

Deoksiribonükleik asit ( DNA ) ilk olarak 1869'da Friedrich Miescher tarafından keşfedildi ve izole edildi , ancak genetik planı hayata geçirmek için DNA'dan ziyade proteinlerin tutulduğu düşünüldüğünden, onlarca yıl üzerinde çalışılmadı. Bu durum 1944'ten sonra Oswald Avery , Colin MacLeod ve Maclyn McCarty'nin saflaştırılmış DNA'nın bir bakteri türünü diğerine değiştirebileceğini gösteren bazı deneyleri sonucunda değişti . Bu, DNA'nın hücrelerin özelliklerini dönüştürebildiği ilk kez gösterildi.

1953'te James Watson ve Francis Crick , Rosalind Franklin tarafından incelenen kristalize X-ışını yapılarına dayanan çift ​​sarmallı DNA modellerini ortaya koydular . Modele göre DNA, birbirinin etrafına sarılmış, hidrojen bağlarıyla birbirine bağlanmış ve zıt yönlerde ilerleyen iki nükleotid dizisinden oluşur. Her iplikçik, dört tamamlayıcı nükleotidden oluşur - adenin (A), sitozin (C), guanin (G) ve timin (T) - bir iplikte A her zaman diğerinde T ile eşleşir ve C her zaman G ile eşleşir. Böyle bir yapının, her bir ipliğin diğerini yeniden yapılandırmak için kullanılmasına izin verdiğini öne sürdüler; bu, nesiller arasında kalıtsal bilgilerin aktarılmasında merkezi bir fikirdi.

Frederick Sanger , dizilemenin öncüsü. Sanger, biri protein dizilimi , diğeri DNA dizilimi için olmak üzere iki Nobel ödülü alan az sayıdaki bilim insanından biridir .

Proteinlerin sıralanmasının temeli ilk olarak, 1955 yılında pankreas tarafından salgılanan küçük bir protein olan insülindeki tüm amino asitlerin sırasını tamamlayan Frederick Sanger'in çalışmasıyla atıldı . Bu, proteinlerin sıvı içinde asılı duran rastgele bir malzeme karışımından ziyade belirli bir moleküler desene sahip kimyasal varlıklar olduğuna dair ilk kesin kanıtı sağladı. Sanger'in insülini dizilemedeki başarısı, şimdiye kadar DNA'nın bir hücre içindeki protein oluşumunu nasıl yönettiğini anlamaya çalışan Watson ve Crick de dahil olmak üzere x-ışını kristalograflarını teşvik etti. Ekim 1954'te Frederick Sanger tarafından verilen bir dizi konferansa katıldıktan kısa bir süre sonra, Crick, DNA'daki nükleotitlerin düzenlenmesinin proteinlerdeki amino asit dizisini belirlediğini ve bunun da bir proteinin işlevini belirlemeye yardımcı olduğunu iddia eden bir teori geliştirmeye başladı. Bu teoriyi 1958'de yayınladı.

RNA dizilimi

RNA dizilimi , nükleotid dizilemenin en eski biçimlerinden biriydi. RNA dizilemesinin en önemli dönüm noktası, 1972 ve 1976'da Walter Fiers ve Ghent Üniversitesi'nde ( Ghent , Belçika ) çalışma arkadaşları tarafından tanımlanan ve yayınlanan, Bakteriyofaj MS2'nin ilk tam geninin ve tam genomunun dizisidir . Geleneksel RNA dizilimi yöntemler, dizilenmesi gereken bir cDNA molekülünün oluşturulmasını gerektirir .

Erken DNA dizileme yöntemleri

DNA dizilerini belirlemek için birinci yöntem tarafından kurulan bir yere özgü bir primer uzatma stratejisi dahil Ray Wu de Cornell Üniversitesi , yapışkan uçları dizisine kullanılan her iki belirgin mevcut dizileme şemalarında olan Şekil 1970. DNA polimeraz kataliz ve spesifik nükleotid etiketleme, içinde lambda faj DNA'sı. 1970 ve 1973 yılları arasında Wu, R Padmanabhan ve meslektaşları, bu yöntemin sentetik lokasyona özgü primerler kullanılarak herhangi bir DNA dizisini belirlemek için kullanılabileceğini gösterdi. Frederick Sanger daha sonra , Cambridge , İngiltere'deki MRC Center'da daha hızlı DNA dizileme yöntemleri geliştirmek için bu primer uzatma stratejisini benimsedi ve 1977'de "zincir sonlandırıcı inhibitörlerle DNA dizilimi" için bir yöntem yayınladı . Harvard'dan Walter Gilbert ve Allan Maxam da geliştirdi "Kimyasal bozunma yoluyla DNA dizilemesi" için bir tane de dahil olmak üzere dizileme yöntemleri. 1973'te Gilbert ve Maxam, dolaşan nokta analizi olarak bilinen bir yöntem kullanarak 24 baz çiftinin dizisini bildirdiler. Dizilemedeki ilerlemeler , DNA örneklerinin virüsler dışındaki kaynaklardan izole edilmesine izin veren rekombinant DNA teknolojisinin eşzamanlı gelişimi ile desteklendi .

Tam genomların dizilenmesi

5,386 bp bakteriyofaj genomu φX174 . Her renkli blok bir geni temsil eder.

Dizilenecek ilk tam DNA genomu , 1977'de bakteriyofaj φX174'ün genomuydu . Tıbbi Araştırma Konseyi bilim adamları , 1984'te Epstein-Barr virüsünün tam DNA dizisini deşifre ettiler ve bunun 172.282 nükleotit içerdiğini buldular. Dizinin tamamlanması, DNA dizilemesinde önemli bir dönüm noktası oldu çünkü virüse ilişkin önceden hiçbir genetik profil bilgisi olmadan elde edildi.

Elektroforez sırasında dizileme reaksiyon karışımlarının DNA moleküllerini hareketsizleştirici bir matris üzerine aktarmak için radyoaktif olmayan bir yöntem, 1980'lerin başında Herbert Pohl ve çalışma arkadaşları tarafından geliştirilmiştir. AB genom dizileme programı çerçevesinde yoğun olarak kullanılan GATC Biotech tarafından "Direct-Blotting-Electrophoresis-System GATC 1500" adlı DNA dizileyicinin ticarileştirilmesini takiben , Saccharomyces cerevisiae kromozom II mayasının tam DNA dizisi . Leroy E. Hood'un California Institute of Technology'deki laboratuvarı 1986'da ilk yarı otomatik DNA dizileme makinesini duyurdu. Bunu, Applied Biosystems'in 1987'de ilk tam otomatik dizileme makinesi ABI 370'i pazarlaması ve Dupont's tarafından izledi. Dört dideoksinükleotidin tamamının tek bir şeritte tanımlanmasını sağlayan yeni bir floresan etiketleme tekniği kullanan Genesis 2000. 1990'a gelindiğinde, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH), Mycoplasma capricolum , Escherichia coli , Caenorhabditis elegans ve Saccharomyces cerevisiae üzerinde taban başına 0,75 ABD doları maliyetle büyük ölçekli dizileme denemelerine başlamıştı . Bu arada, insan genomunun kodlama fraksiyonunu yakalama girişimi olan Craig Venter'in laboratuvarında, eksprese edilmiş dizi etiketleri adı verilen insan cDNA dizilerinin dizilenmesi başladı . 1995 yılında Venter, Hamilton Smith ve The Institute for Genomic Research'teki (TIGR) meslektaşları, serbest yaşayan bir organizma olan Haemophilus influenzae bakterisinin ilk tam genomunu yayınladılar . Dairesel kromozom 1.830.137 baz içerir ve Science dergisinde yayınlanması, ilk haritalama çabalarına olan ihtiyacı ortadan kaldırarak, tam genomlu av tüfeği dizilemesinin ilk yayınlanmış kullanımı olarak işaretlenmiştir.

2001 yılına kadar, insan genomunun taslak dizisini üretmek için av tüfeği dizileme yöntemleri kullanıldı.

Yüksek verimli sıralama (HTS) yöntemleri

Sıralama teknolojisinin tarihi 

1990'ların ortalarından sonlarına kadar birçok yeni DNA dizileme yöntemi geliştirildi ve 2000 yılına kadar ticari DNA dizileyicilerinde uygulandı . Bunlara birlikte "yeni nesil" veya "ikinci nesil" dizileme (NGS) yöntemleri adı verildi. Sanger dizilemesi de dahil olmak üzere onları önceki yöntemlerden ayırt etmek için . Birinci nesil dizilemenin aksine, NGS teknolojisi tipik olarak yüksek düzeyde ölçeklenebilir olmasıyla karakterize edilir ve tüm genomun bir kerede dizilenmesine izin verir. Genellikle bu, genomu küçük parçalara bölerek, bir parça için rastgele numune alarak ve aşağıda açıklananlar gibi çeşitli teknolojilerden birini kullanarak onu dizileyerek gerçekleştirilir. Tüm bir genom mümkündür, çünkü birden fazla fragman aynı anda sıralanır (ona "büyük ölçüde paralel" sıralama adını verir) otomatik bir işlemde.

NGS teknolojisi, araştırmacıları sağlığa ilişkin içgörüler aramaya, antropologlara insanın kökenini araştırmak için muazzam bir güç verdi ve " Kişiselleştirilmiş Tıp " hareketini hızlandırıyor . Ancak, aynı zamanda daha fazla hata payının kapısını da açmıştır. NGS verilerinin hesaplamalı analizini gerçekleştirmek için, genellikle her biri kendi algoritmasına sahip olan CSI NGS Portal gibi çevrimiçi platformlarda derlenen birçok yazılım aracı vardır. Bir yazılım paketindeki parametreler bile analizin sonucunu değiştirebilir. Ek olarak, DNA dizilemesi ile üretilen büyük miktardaki veri, dizi analizi için yeni yöntemlerin ve programların geliştirilmesini de gerektirmiştir. NGS alanında standartlar geliştirmeye yönelik çeşitli çabalar, çoğu bireysel laboratuvarlardan kaynaklanan küçük ölçekli çabalar olan bu zorlukları ele almaya teşebbüs edilmiştir. Yakın zamanda, büyük, organize, FDA tarafından finanse edilen bir çaba BioCompute standardında doruğa ulaştı .

26 Ekim 1990'da Roger Tsien , Pepi Ross, Margaret Fahnestock ve Allan J Johnston, DNA dizileri (lekeler ve tek DNA molekülleri) üzerindeki çıkarılabilir 3' blokerlerle adım adım ("baz bazında") dizilemeyi açıklayan bir patent başvurusunda bulundular. 1996 yılında, Pål Nyrén ve Stockholm'deki Royal Institute of Technology'deki öğrencisi Mostafa Ronaghi , piro-sıralama yöntemini yayınladılar .

1 Nisan 1997'de Pascal Mayer  [ fr ] ve Laurent Farinelli, DNA koloni dizilimini tanımlayan Dünya Fikri Mülkiyet Örgütü'ne patentler sundu. Bu patentte açıklanan DNA numunesi hazırlama ve rastgele yüzey polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) dizileme yöntemleri, Roger Tsien ve arkadaşlarının "baz bazında" dizileme yöntemiyle birleştirilmiş, şimdi Illumina'nın Hi-Seq'inde uygulanmaktadır. genom dizileyiciler

1998'de Washington Üniversitesi'nden Phil Green ve Brent Ewing, yaygın olarak benimsenen ve hala bir dizileme platformunun doğruluğunu değerlendirmek için en yaygın ölçüm olan bir dönüm noktası analiz tekniği olan sıralayıcı veri analizi için phred kalite puanlarını tanımladılar .

Lynx Therapeutics , 2000 yılında kitlesel paralel imza dizilimini (MPSS) yayınladı ve pazarladı . Bu yöntem, paralelleştirilmiş, adaptör/bağlama aracılı, boncuk tabanlı bir dizileme teknolojisi içeriyordu ve ticari olarak mevcut ilk "yeni nesil" dizileme yöntemi olarak hizmet etti, ancak hayır. DNA dizileyicileri bağımsız laboratuvarlara satıldı.

Temel yöntemler

Maxam-Gilbert dizilemesi

Allan Maxam ve Walter Gilbert , 1977'de DNA'nın kimyasal modifikasyonuna ve ardından belirli bazlarda bölünmeye dayanan bir DNA dizileme yöntemi yayınladı. Kimyasal dizileme olarak da bilinen bu yöntem, daha fazla klonlama olmadan saflaştırılmış çift sarmallı DNA örneklerinin kullanılmasına izin verdi. Bu yöntemin radyoaktif etiketlemeyi kullanması ve teknik karmaşıklığı, Sanger yöntemlerinde iyileştirmeler yapıldıktan sonra yaygın kullanımı engelledi.

Maxam-Gilbert dizilemesi, DNA'nın bir 5' ucunda radyoaktif etiketleme ve dizilenecek DNA parçasının saflaştırılmasını gerektirir. Kimyasal işlem daha sonra dört reaksiyonun (G, A+G, C, C+T) her birinde dört nükleotid bazından bir veya ikisinde küçük bir oranda kırılmalar üretir. Modifiye edici kimyasalların konsantrasyonu, DNA molekülü başına ortalama bir modifikasyon eklemek için kontrol edilir. Böylece, her molekülde radyo-etiketli uçtan ilk "kesilmiş" bölgeye kadar bir dizi etiketli fragman üretilir. Dört reaksiyondaki parçalar, boyut ayrımı için denatüre edici akrilamid jellerinde yan yana elektroforeze tabi tutulur. Fragmanları görselleştirmek için jel, otoradyografi için X-ışını filmine maruz bırakılarak, her biri radyo etiketli bir DNA fragmanına karşılık gelen bir dizi koyu bant elde edilir, bu da diziden çıkarsanabilir.

Zincir sonlandırma yöntemleri

Zincir sonlandırma yöntemi geliştirdiği Frederick Sanger ve 1977 yılında arkadaşları yakında göreceli kolaylığı ve güvenilirliği sayesinde tercih edilen yöntem haline geldi. İcat edildiğinde, zincir sonlandırıcı yöntemi, Maxam ve Gilbert yönteminden daha az toksik kimyasal ve daha düşük miktarda radyoaktivite kullandı. Karşılaştırma kolaylığı nedeniyle, Sanger yöntemi kısa sürede otomatikleştirildi ve ilk nesil DNA dizileyicilerinde kullanılan yöntem oldu .

Sanger dizileme, 1980'lerden 2000'lerin ortalarına kadar geçerli olan bir yöntemdir. Bu süre zarfında, floresan etiketleme, kılcal elektroforez ve genel otomasyon gibi teknikte büyük ilerlemeler kaydedildi. Bu gelişmeler çok daha verimli sıralamaya izin vererek daha düşük maliyetlere yol açtı. Seri üretim biçimindeki Sanger yöntemi, 2001 yılında genomik çağını başlatan ilk insan genomunu üreten teknolojidir . Ancak, daha sonra on yıl içinde, radikal olarak farklı yaklaşımlar pazara ulaştı ve genom başına maliyeti 2001'de 100 milyon dolardan 2011'de 10.000 dolara düşürdü.

Büyük ölçekli sıralama ve de novo sıralama

Genomik DNA rastgele parçalara bölünür ve bir bakteri kütüphanesi olarak klonlanır. Bireysel bakteri klonlarından elde edilen DNA dizilenir ve dizilim, örtüşen DNA bölgeleri kullanılarak birleştirilir.(genişletmek için tıklayın)

Büyük ölçekli dizileme genellikle tüm kromozomlar gibi çok uzun DNA parçalarını dizilemeyi amaçlar , ancak büyük ölçekli dizileme, faj gösteriminde olduğu gibi çok sayıda kısa dizi oluşturmak için de kullanılabilir . Kromozomlar gibi daha uzun hedefler için, yaygın yaklaşımlar, büyük DNA fragmanlarını daha kısa DNA fragmanlarına kesmek ( kısıtlama enzimleri ile ) veya makaslamaktan (mekanik kuvvetlerle) oluşur. Parçalanmış DNA daha sonra bir DNA vektörüne klonlanabilir ve Escherichia coli gibi bir bakteriyel konakçıda amplifiye edilebilir . Tek tek bakteri kolonilerinden saflaştırılan kısa DNA parçaları, tek tek dizilenir ve elektronik olarak uzun, bitişik bir dizi halinde birleştirilir . Çalışmalar, tek tip boyutta DNA parçalarını toplamak için bir boyut seçim adımı eklemenin, dizileme verimliliğini ve genom montajının doğruluğunu artırabileceğini göstermiştir. Bu çalışmalarda, otomatik boyutlandırmanın manuel jel boyutlandırmadan daha tekrarlanabilir ve kesin olduğu kanıtlanmıştır.

" De novo dizileme" terimi, spesifik olarak, önceden bilinen bir diziye sahip olmayan DNA dizisini belirlemek için kullanılan yöntemlere atıfta bulunur. De novo , Latince'den "başlangıçtan itibaren" olarak tercüme edilir. Birleştirilmiş dizideki boşluklar, primer yürüme ile doldurulabilir . Farklı stratejiler, hız ve doğruluk açısından farklı ödünleşimlere sahiptir; av tüfeği yöntemleri genellikle büyük genomları sıralamak için kullanılır, ancak montajı karmaşık ve zordur, özellikle dizi tekrarları genellikle genom montajında ​​boşluklara neden olur.

Çoğu dizileme yaklaşımı , moleküler saptama yöntemleri tek molekül dizilimi için yeterince hassas olmadığından, tek tek DNA moleküllerini çoğaltmak için bir in vitro klonlama adımı kullanır. Emülsiyon PCR, bir yağ fazı içinde sulu damlacıklarda primer kaplı boncuklar ile birlikte tek tek DNA moleküllerini izole eder. Bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) daha sonra her bir boncuğu DNA molekülünün klonal kopyalarıyla kaplar ve ardından daha sonraki dizileme için hareketsiz hale getirir. Emülsiyon PCR, Marguilis ve arkadaşları tarafından geliştirilen yöntemlerde kullanılmaktadır. ( 454 Life Sciences tarafından ticarileştirilmiştir ), Shendure ve Porreca ve ark. ( " polony dizilimi " olarak da bilinir ) ve SOLiD dizilimi ( Agencourt tarafından geliştirilmiştir , daha sonra Applied Biosystems , şimdi ise Life Technologies ). Emulsion PCR, 10x Genomics tarafından geliştirilen GemCode ve Chromium platformlarında da kullanılmaktadır .

av tüfeği dizilimi

Shotgun dizileme, tüm kromozomları içeren 1000 baz çiftinden daha uzun DNA dizilerinin analizi için tasarlanmış bir dizileme yöntemidir. Bu yöntem, hedef DNA'nın rastgele parçalara ayrılmasını gerektirir. Bireysel fragmanların sıralanmasından sonra, diziler örtüşen bölgeleri temelinde yeniden birleştirilebilir.

Yüksek verimli yöntemler

Çoklu, parçalanmış dizi okumaları, örtüşen alanları temelinde bir araya getirilmelidir.

Yeni nesil "kısa okuma" ve üçüncü nesil "uzun okuma" sıralama yöntemlerini içeren yüksek verimli dizileme, ekzom dizileme, genom dizileme, genom yeniden dizileme, transkriptom profilleme ( RNA-Seq ), DNA-protein etkileşimleri için geçerlidir. ( ChIP dizilimi ) ve epigenom karakterizasyonu. Yeniden dizileme gereklidir, çünkü bir türün tek bir bireyinin genomu, aynı türün diğer bireyleri arasındaki tüm genom varyasyonlarını göstermeyecektir.

Düşük maliyetli dizileme için yüksek talep , dizileme sürecini paralel hale getiren ve aynı anda binlerce veya milyonlarca dizi üreten yüksek verimli dizileme teknolojilerinin geliştirilmesine neden olmuştur . Yüksek verimli dizileme teknolojileri, standart boya sonlandırıcı yöntemleriyle mümkün olanın ötesinde DNA dizileme maliyetini düşürmeyi amaçlamaktadır. Ultra yüksek verimli dizilemede, 500.000'e kadar sentez yoluyla dizileme işlemi paralel olarak çalıştırılabilir. Bu tür teknolojiler, bir gün gibi kısa bir sürede tüm bir insan genomunun dizilenmesine olanak sağladı. 2019 itibariyle, yüksek verimli sıralama ürünlerinin geliştirilmesinde kurumsal liderler arasında Illumina , Qiagen ve ThermoFisher Scientific yer aldı .

Yüksek verimli sıralama yöntemlerinin karşılaştırılması
Yöntem Okuma uzunluğu Doğruluk (konsensüs değil tek okuma) Çalışma başına okuma Çalışma başına süre 1 milyar baz başına maliyet (ABD doları cinsinden) Avantajlar Dezavantajları
Tek moleküllü gerçek zamanlı dizileme (Pacific Biosciences) 30.000 bp ( N50 );

maksimum okuma uzunluğu >100.000 baz

%87 ham okuma doğruluğu Sequel 2 SMRT hücresi başına 4.000.000, 100–200 gigabaz 30 dakika ila 20 saat $7.2-$43,3 Hızlı. 4mC, 5mC, 6mA'yı algılar. Orta verim. Ekipman çok pahalı olabilir.
İyon yarı iletken (İyon Torrent sıralaması) 600 bp'ye kadar %99.6 80 milyona kadar 2 saat $66.8-$950 Daha az pahalı ekipman. Hızlı. Homopolimer hataları.
Pyrosequencing (454) 700 bp %99.9 1 milyon 24 saat 10.000$ Uzun okuma boyutu. Hızlı. Koşular pahalıdır. Homopolimer hataları.
Sentez yoluyla sıralama (Illumina) MiniSeq, SonrakiSeq: 75–300 bp;

MiSeq: 50–600 bp;

HiSeq 2500: 50–500 bp;

HiSeq 3/4000: 50–300 bp;

HiSeq X: 300 bp

%99,9 (Phred30) MiniSeq/MiSeq: 1–25 Milyon;

SonrakiSıra: 130-00 Milyon;

HiSeq 2500: 300 milyon – 2 milyar;

HiSeq 3/4000 2,5 milyar;

HiSeq X: 3 milyar

Sıralayıcıya ve belirtilen okuma uzunluğuna bağlı olarak 1 ila 11 gün 5 ila 150 dolar Sıralayıcı modeline ve istenen uygulamaya bağlı olarak yüksek sıra verimi potansiyeli. Ekipman çok pahalı olabilir. Yüksek konsantrasyonlarda DNA gerektirir.
Kombinatoryal prob bağlantı sentezi (cPAS-BGI/MGI) BGISEQ-50: 35-50bp;

MGISEQ 200: 50-200bp;

BGISEQ-500, MGISEQ-2000: 50-300bp

%99,9 (Phred30) BGISEQ-50: 160M;

MGISEQ 200: 300M;

BGISEQ-500: akış hücresi başına 1300M;

MGISEQ-2000: 375M FCS akış hücresi, akış hücresi başına 1500M FCL akış hücresi.

Cihaza bağlı olarak 1 ila 9 gün, okuma uzunluğu ve bir seferde akış hücrelerinin sayısı. $5-120$
Ligasyon ile sıralama (SOLiD sıralama) 50+35 veya 50+50 bp %99.9 1,2 ila 1,4 milyar 1 ila 2 hafta 60-130 dolar Baz başına düşük maliyet. Diğer yöntemlere göre daha yavaştır. Palindromik dizileri sıralama sorunları var.
Nanopor Sıralaması Cihaza değil, kitaplık hazırlığına bağlıdır, bu nedenle kullanıcı okuma uzunluğunu seçer (2.272.580 bp'ye kadar rapor edilir). ~92–97% tek okuma kullanıcı tarafından seçilen okuma uzunluğuna bağlıdır gerçek zamanlı olarak aktarılan veriler. 1 dakika ila 48 saat arasında seçim yapın 7-100 dolar En uzun bireysel okuma. Erişilebilir kullanıcı topluluğu. Taşınabilir (Avuç içi büyüklüğünde). Diğer makinelerden daha düşük verim, 90'larda tek okuma doğruluğu.
GenapSys Sıralaması Yaklaşık 150 bp tek uçlu %99,9 (Phred30) 1 ila 16 milyon 24 saat civarında 667 dolar Düşük maliyetli enstrüman (10.000 $)
Zincir sonlandırma (Sanger sıralama) 400 ila 900 bp %99.9 Yok 20 dakika ila 3 saat 2.400.000 $ Birçok uygulama için kullanışlıdır. Daha büyük sıralama projeleri için daha pahalı ve pratik değildir. Bu yöntem ayrıca zaman alıcı plazmit klonlama veya PCR adımını gerektirir.

Uzun okuma sıralama yöntemleri

Tek moleküllü gerçek zamanlı (SMRT) dizileme

SMRT sıralama, sentez yaklaşımıyla sıralamaya dayanır. DNA, sıfır modlu dalga kılavuzlarında (ZMW'ler) sentezlenir - kuyunun dibinde bulunan yakalama araçlarıyla küçük, kuyuya benzer kaplar. Sıralama, modifiye edilmemiş polimeraz (ZMW tabanına bağlı) ve çözelti içinde serbestçe akan floresan etiketli nükleotidler kullanılarak gerçekleştirilir. Kuyular, yalnızca kuyunun dibinde meydana gelen floresansın algılanacağı şekilde inşa edilmiştir. Floresan etiket, DNA zincirine dahil edilmesi üzerine nükleotitten ayrılır ve geriye modifiye edilmemiş bir DNA zinciri kalır. SMRT teknolojisi geliştiricisi Pacific Biosciences'a (PacBio) göre , bu metodoloji nükleotid modifikasyonlarının (sitozin metilasyonu gibi) saptanmasına izin verir. Bu, polimeraz kinetiğinin gözlemlenmesi yoluyla olur. Bu yaklaşım, ortalama 5 kilobazlık okuma uzunluklarıyla 20.000 nükleotid veya daha fazlasının okunmasına izin verir. 2015 yılında Pacific Biosciences, PacBio RS II cihazındaki 150.000 ZMW'ye kıyasla 1 milyon ZMW ile Sequel System adlı yeni bir sıralama aracının piyasaya sürüldüğünü duyurdu. SMRT dizilimi, " üçüncü nesil " veya "uzun okuma" dizilimi olarak adlandırılır.

Nano gözenekli DNA dizilimi

Nanopordan geçen DNA iyon akımını değiştirir. Bu değişiklik, DNA dizisinin şekline, boyutuna ve uzunluğuna bağlıdır. Nükleotidin her tipi, iyon akışını farklı bir süre boyunca gözenekten bloke eder. Yöntem, modifiye edilmiş nükleotidler gerektirmez ve gerçek zamanlı olarak gerçekleştirilir. Nanopor dizilimi, SMRT dizilimi ile birlikte " üçüncü nesil " veya "uzun okuma" dizilimi olarak adlandırılır.

Bu yönteme yönelik erken endüstriyel araştırmalar, elektrik sinyallerinin okunmasının, siklodekstrin ile kovalent olarak bağlanan alfa(a)-hemolizin gözeneklerinden geçen nükleotidler olarak gerçekleştiği, 'eksonükleaz dizilimi' adı verilen bir tekniğe dayanıyordu . Ancak müteakip ticari yöntem olan 'iplik dizilimi', DNA bazlarını sağlam bir zincirde sıraladı.

Gelişmekte olan iki ana nanopor dizilimi alanı, katı hal nanopor dizilimi ve protein bazlı nanopor dizilimidir. Protein nanopor dizilimi, a-hemolizin, MspA ( Mycobacterium smegmatis Porin A) veya CssG gibi membran protein komplekslerini kullanır ve bunlar, bireysel ve nükleotit grupları arasında ayrım yapma yetenekleri göz önüne alındığında büyük umut vaat eder. Buna karşılık, katı hal nano gözenek dizilimi, silikon nitrür ve alüminyum oksit gibi sentetik malzemeleri kullanır ve üstün mekanik kabiliyeti ve termal ve kimyasal kararlılığı nedeniyle tercih edilir. Nanopor dizisinin çapları sekiz nanometreden daha küçük olan yüzlerce gözenek içerebileceği göz önüne alındığında, bu tür dizileme için üretim yöntemi esastır.

Konsept, tek sarmallı DNA veya RNA moleküllerinin, sekiz nanometreden daha küçük olabilen biyolojik bir gözenek boyunca katı bir lineer dizide elektroforetik olarak sürülebileceği ve moleküllerin hareket ederken iyonik bir akım saldığı göz önüne alındığında tespit edilebileceği fikrinden kaynaklanmıştır. gözenek. Gözenek, farklı bazları tanıyabilen bir algılama bölgesi içerir; her bir baz, daha sonra değerlendirilen, gözenekten geçerken bazların dizisine karşılık gelen çeşitli zamana özgü sinyaller üretir. Gözenek yoluyla DNA taşınması üzerinde hassas kontrol, başarı için çok önemlidir. Eksonükleazlar ve polimerazlar gibi çeşitli enzimler, bunları gözenek girişinin yakınına yerleştirerek bu süreci yumuşatmak için kullanılmıştır.

Kısa okuma sıralama yöntemleri

Büyük ölçüde paralel imza dizileme (MPSS)

Yüksek verimli dizileme teknolojilerinin ilki, kitlesel paralel imza dizileme (veya MPSS), 1990'larda Sydney Brenner ve Sam Eletr tarafından 1992 yılında kurulan Lynx Therapeutics'te geliştirildi . MPSS, karmaşık bir adaptör ligasyonu yaklaşımını, ardından adaptör kodunu çözmeyi ve diziyi dört nükleotitlik artışlarla okuyarak, boncuk tabanlı bir yöntemdi. Bu yöntem, diziye özgü önyargıya veya belirli dizilerin kaybına duyarlı hale getirdi. Teknoloji çok karmaşık olduğu için, MPSS yalnızca Lynx Therapeutics tarafından 'kurum içi' uygulandı ve bağımsız laboratuvarlara DNA dizileme makinesi satılmadı. Lynx Therapeutics , 2004 yılında Solexa (daha sonra Illumina tarafından satın alındı ) ile birleşti ve MPSS'yi geçersiz kılan Manteia Predictive Medicine'den elde edilen daha basit bir yaklaşım olan sentez yoluyla sıralamanın geliştirilmesine yol açtı . Bununla birlikte, MPSS çıktısının temel özellikleri, yüz binlerce kısa DNA dizisi dahil olmak üzere, daha sonraki yüksek verimli veri türleri için tipikti. MPSS durumunda, bunlar tipik olarak gen ekspresyon seviyelerinin ölçümleri için cDNA'yı sıralamak için kullanıldı .

polonya dizilimi

Polony sekanslama laboratuarında geliştirilmiş yöntem olup, George M. Church Harvard, birinci sıralama olan sistemlerin arasındaydı ve tam sekansı için kullanılmıştır , E. coli 2005 genom Bu bir in vitro eşli-etiket kitaplığı Birleştirilen emülsiyon PCR, otomatik bir mikroskop ve bir E. coli genomunu >%99,9999 doğrulukta ve Sanger dizilemesinin yaklaşık 1/9'u maliyette dizilemek için ligasyona dayalı dizileme kimyası . Teknoloji, Agencourt Biosciences'a lisanslandı, daha sonra Agencourt Personal Genomics'e dönüştürüldü ve sonunda Applied Biosystems SOLiD platformuna dahil edildi . Applied Biosystems daha sonra şu anda Thermo Fisher Scientific'in bir parçası olan Life Technologies tarafından satın alındı .

454 pyrosequencing

Pyrosequencing'in paralelleştirilmiş bir versiyonu , o zamandan beri Roche Diagnostics tarafından satın alınan 454 Life Sciences tarafından geliştirilmiştir . Yöntem, bir yağ çözeltisindeki (emülsiyon PCR) su damlacıklarının içindeki DNA'yı çoğaltır ve her damlacık, daha sonra bir klonal koloni oluşturan tek bir primer kaplı boncuk üzerine eklenmiş tek bir DNA şablonu içerir. Sıralama makinesi, her biri tek bir boncuk ve sıralama enzimleri içeren birçok pikolitre hacimli kuyu içerir . Pyrosequencing , yeni oluşan DNA'ya eklenen tek tek nükleotitlerin saptanması için ışık üretmek üzere lusiferaz kullanır ve birleştirilmiş veriler, dizi okumaları oluşturmak için kullanılır . Bu teknoloji, bir uçta Sanger dizilimine ve diğer uçta Solexa ve SOLiD'ye kıyasla orta düzeyde okuma uzunluğu ve taban başına fiyat sağlar.

Illumina (Solexa) dizilimi

Solexa , şimdi parçası Illumina tarafından kurulmuştur Shankar Balasubramanian ve David Klenerman 1998 yılında, ve geri dönüşümlü boya Terminatörler teknoloji ve mühendislik polimerazlar dayalı bir sıralama yöntemi geliştirdi. Tersinir sonlandırılmış kimya kavramı, Paris'teki Pasteur Enstitüsü'nde Bruno Canard ve Simon Sarfati tarafından icat edildi. İlgili patentlerde adı geçenler tarafından Solexa'da dahili olarak geliştirilmiştir. 2004 yılında Solexa , 1997 yılında Pascal Mayer  [ fr ] ve Laurent Farinelli tarafından icat edilen büyük ölçüde paralel bir sıralama teknolojisini elde etmek için Manteia Predictive Medicine şirketini satın aldı . Bir yüzey üzerinde DNA'nın klonal amplifikasyonunu içeren "DNA kümeleri" veya "DNA kolonileri" üzerine kuruludur. Küme teknolojisi, Lynx Therapeutics of California ile birlikte satın alındı. Solexa Ltd. daha sonra Lynx ile birleşerek Solexa Inc.'i kurdu.

Illumina HiSeq 2500 sıralayıcı
Illumina NovaSeq 6000 akış hücresi

Bu yöntemde, DNA molekülleri ve primerler önce bir slayt veya akış hücresine eklenir ve polimeraz ile amplifiye edilir, böylece daha sonra "DNA kümeleri" olarak adlandırılan lokal klonal DNA kolonileri oluşturulur. Diziyi belirlemek için, dört tip tersinir sonlandırıcı baz (RT-bazları) eklenir ve dahil edilmemiş nükleotitler yıkanarak uzaklaştırılır. Bir kamera, floresan etiketli nükleotidlerin görüntülerini alır . Daha sonra boya, terminal 3' bloker ile birlikte DNA'dan kimyasal olarak çıkarılır ve bir sonraki döngünün başlamasına izin verilir. Pyrosequencing'den farklı olarak, DNA zincirleri bir seferde bir nükleotid uzatılır ve gecikmeli bir anda görüntü alımı gerçekleştirilebilir, bu da tek bir kameradan alınan ardışık görüntüler tarafından çok büyük DNA kolonisi dizilerinin yakalanmasına izin verir.

Illumina MiSeq sıralayıcı

Enzimatik reaksiyonun ayrıştırılması ve görüntü yakalama, optimum verim ve teorik olarak sınırsız sıralama kapasitesi sağlar. Optimum bir konfigürasyonla, nihai olarak ulaşılabilen cihaz verimi, bu nedenle yalnızca kameranın analogdan dijitale dönüştürme oranı, kamera sayısıyla çarpılması ve onları en iyi şekilde görselleştirmek için gereken DNA kolonisi başına piksel sayısına bölünmesiyle belirlenir (yaklaşık olarak 10 piksel/koloni). 2012'de, 10 MHz'den fazla A/D dönüşüm hızında çalışan kameralar ve mevcut optikler, akışkanlar ve enzimatikler ile verim 1 milyon nükleotit/saniyenin katları olabilir, bu da cihaz başına saatte 1x kapsama alanıyla kabaca 1 insan genomuna karşılık gelir , ve alet başına günde 1 insan genomu yeniden dizilimi (yaklaşık 30x'te) (tek bir kamera ile donatılmış).

Kombinatoryal prob bağlantı sentezi (cPAS)

Bu yöntem ile tarif edilen birleştirici sonda çapa ligasyonu teknolojisi (CPAL) için yükseltilmiş bir değişikliktir Komple Genomics Çinli genom şirket haline parçası beri gelmiştir BGI 2013 yılında iki şirket daha uzun okuma uzunlukları, reaksiyon süresi indirimleri ve izin vermek için teknolojiyi rafine sonuçlara daha hızlı ulaşma süresi. Ek olarak, veriler artık standart FASTQ dosya formatında bitişik tam uzunlukta okumalar olarak oluşturulmakta ve çoğu kısa okumaya dayalı biyoinformatik analiz boru hatlarında olduğu gibi kullanılabilir.

Bu yüksek verimli dizileme teknolojisinin temelini oluşturan iki teknoloji, DNA nanotopları (DNB) ve katı bir yüzeye nanoball eki için desenli dizilerdir. DNA nanotopları basitçe, çift sarmallı, adaptörle bağlanmış kitaplıkların denatüre edilmesi ve ileri sarmalın bir ssDNA dairesi oluşturmak üzere yalnızca bir atel oligonükleotidine bağlanmasıyla oluşturulur. DNA ekini içeren dairelerin aslına uygun kopyaları, yaklaşık 300-500 kopya üreten Rolling Circle Amplification kullanılarak üretilir. Uzun ssDNA dizisi, yaklaşık 220 nm çapında üç boyutlu bir nanotop yapısı üretmek için kendi üzerine katlanır. DNB'lerin yapılması, akış hücresinde kitaplığın PCR kopyalarını oluşturma ihtiyacının yerini alır ve bu nedenle büyük oranlarda yinelenen okumaları, adaptör-adaptör ligasyonlarını ve PCR kaynaklı hataları ortadan kaldırabilir.

Bir BGI MGICEQ-2000RS sıralayıcı

Pozitif yüklü noktaların desenli dizisi, fotolitografi ve dağlama teknikleri ve ardından bir dizileme akış hücresi oluşturmak için kimyasal modifikasyon yoluyla üretilir. Akış hücresi üzerindeki her nokta yaklaşık 250 nm çapındadır, 700 nm (merkezden merkeze) ile ayrılır ve tek bir negatif yüklü DNB'nin akış hücresine kolayca bağlanmasına ve böylece akış hücresindeki eksik veya fazla kümelenmeyi azaltır.

Sıralama, daha sonra, kombinasyon halinde DNB içindeki belirli bölgelere bağlanan bir oligonükleotid probunun eklenmesiyle gerçekleştirilir. Prob, akış hücresi boyunca aktıktan sonra dört tek geri dönüşümlü olarak inaktive edilmiş, etiketli nükleotitten birinin bağlanmasına izin veren bir çapa görevi görür. Bağlı olmayan nükleotitler, ekli etiketlerin lazerle uyarılmasından önce yıkanır, ardından floresan yayar ve sinyal, baz araması için dijital bir çıkışa dönüştürülen kameralar tarafından yakalanır. Ekli tabanın sonlandırıcısı ve etiketi, döngünün tamamlanmasıyla kimyasal olarak bölünmüştür. Döngü, bir sonraki nükleotidin bağlanmasına ve sinyalinin yakalanmasına izin vermek için akış hücresi boyunca başka bir serbest, etiketli nükleotit akışıyla tekrarlanır. Bu işlem, 2018 itibariyle saniyede yaklaşık 40 milyon nükleotit hızında eklenen DNA parçasının dizisini belirlemek için birkaç kez (genellikle 50 ila 300 kez) tamamlanır.

KATI dizileme

SOLiD platformu için kütüphane hazırlığı
İki tabanlı kodlama şeması. İki tabanlı kodlamada, sondanın 3' ucundaki her benzersiz baz çifti dört olası renkten birine atanır. Örneğin, "AA" maviye, "AC" yeşile atanır, vb. 16 benzersiz çiftin tümü için. Sıralama sırasında, şablondaki her bir baz iki kez sıralanır ve elde edilen verilerin kodu bu şemaya göre çözülür.

Applied Biosystems ' (şimdi bir Life Technologies markası) SOLiD teknolojisi , ligasyon yoluyla sıralamayı kullanır . Burada, sabit uzunluktaki tüm olası oligonükleotitlerden oluşan bir havuz, dizili konuma göre etiketlenir. Oligonükleotitler tavlanır ve bağlanır; sekansları eşleştirmek için DNA ligazı tarafından tercihli ligasyon , o pozisyondaki nükleotit hakkında bilgi veren bir sinyal ile sonuçlanır. Şablondaki her bir baz iki kez sıralanır ve elde edilen verilerin kodu , bu yöntemde kullanılan 2 baz kodlama şemasına göre çözülür . Dizilemeden önce DNA, emülsiyon PCR ile amplifiye edilir. Her biri aynı DNA molekülünün tek kopyalarını içeren elde edilen boncuklar, bir cam slayt üzerine yerleştirilir. Sonuç, Illumina dizilimi ile karşılaştırılabilir miktar ve uzunluk dizileridir. Bu ligasyonu ile sıralama yöntemine palindromik dizilişi, bazı sorunu olduğu bildirilmiştir.

İyon Torrent yarı iletken dizileme

Ion Torrent Systems Inc. (şu anda Life Technologies'e aittir ), standart sıralama kimyasını kullanan, ancak yeni, yarı iletken tabanlı bir algılama sistemine sahip bir sistem geliştirdi. Bu dizileme yöntemi, diğer dizileme sistemlerinde kullanılan optik yöntemlerin aksine , DNA'nın polimerizasyonu sırasında salınan hidrojen iyonlarının saptanmasına dayanır . Dizilenecek bir şablon DNA zinciri içeren bir mikro kuyu, tek bir nükleotid tipi ile doldurulur . Yerleştirilen nükleotid ise tamamlayıcı gelen şablonuna büyüyen sarmalına dahil nükleotid. Bu, bir reaksiyonun meydana geldiğini gösteren aşırı duyarlı bir iyon sensörünü tetikleyen bir hidrojen iyonunun salınmasına neden olur. Eğer homopolimer tekrarlar şablon dizisi içine mevcut olan, birden fazla nükleotid, tek bir döngü içinde dahil edilecektir. Bu, karşılık gelen sayıda salınan hidrojene ve orantılı olarak daha yüksek bir elektronik sinyale yol açar.

TAGGCT şablonunun IonTorrent, PacBioRS ve GridION ile sıralanması

DNA nanotop dizilimi

DNA nanotop dizilimi , bir organizmanın tüm genomik dizisini belirlemek için kullanılan bir tür yüksek verimli dizileme teknolojisidir . Complete Genomics şirketi , bağımsız araştırmacılar tarafından sunulan örnekleri sıralamak için bu teknolojiyi kullanır. Yöntem, küçük genomik DNA parçalarını DNA nanotoplarına yükseltmek için yuvarlanan daire replikasyonunu kullanır . Daha sonra nükleotid dizisini belirlemek için ligasyon yoluyla zincirsiz dizileme kullanılır. Bu DNA dizileme yöntemi, diğer yüksek verimli dizileme platformlarına kıyasla, çalışma başına ve düşük reaktif maliyetlerinde çok sayıda DNA nanotopunun dizilenmesine izin verir . Bununla birlikte, her bir DNA nanotopundan yalnızca kısa DNA dizileri belirlenir ve bu da kısa okumaların bir referans genomla eşlenmesini zorlaştırır. Bu teknoloji, çoklu genom dizileme projeleri için kullanılmış ve daha fazlası için kullanılması planlanmıştır.

Heliskop tek molekül dizilimi

Heliskop dizilimi, Helicos Biosciences tarafından geliştirilen tek moleküllü dizileme yöntemidir . Akış hücresi yüzeyine eklenmiş poli-A kuyruk adaptörleri ile DNA parçalarını kullanır. Sonraki adımlar, floresan etiketli nükleotitlerle (Sanger yönteminde olduğu gibi bir seferde bir nükleotid tipi) akış hücresinin döngüsel yıkamalarıyla uzatmaya dayalı dizilemeyi içerir. Okumalar Heliskop sıralayıcı tarafından gerçekleştirilir. Okumalar kısa, ortalama 35 bp. Bu teknolojiyi özellikle yeni yapan şey, kendi sınıfında amplifiye edilmemiş DNA'yı dizileyen ilk teknoloji olması ve böylece amplifikasyon adımlarıyla ilişkili herhangi bir okuma hatasını önlemesiydi. 2009'da Heliscope kullanılarak bir insan genomu dizilendi, ancak 2012'de şirket iflas etti.

Mikroakışkan Sistemler

DNA'yı sıralamak için kullanılan iki ana mikroakışkan sistemi vardır; damlacık tabanlı mikroakışkanlar ve dijital mikroakışkanlar . Mikroakışkan cihazlar, mevcut sıralama dizilerinin mevcut sınırlamalarının çoğunu çözer.

Abate et al. DNA dizilimi için damlacık tabanlı mikroakışkan cihazların kullanımını inceledi. Bu cihazlar, saniyede binlerce oranında pikolitre büyüklüğünde damlacıklar oluşturma ve işleme yeteneğine sahiptir. Cihazlar polidimetilsiloksandan (PDMS) oluşturuldu ve damlacıklarda kapsanan DNA dizilerini okumak için Forster rezonans enerji transferi, FRET tahlillerini kullandı. Dizideki her konum, belirli bir 15 baz dizisi için test edildi.

Fuar ve ark. DNA pyrosequencing'i incelemek için dijital mikroakışkan cihazları kullandı . Önemli avantajlar arasında cihazın taşınabilirliği, reaktif hacmi, analiz hızı, seri üretim yetenekleri ve yüksek verim sayılabilir. Bu çalışma, dijital cihazların piro-sıralama için kullanılabileceğini gösteren bir kavram kanıtı sağladı; Çalışma, enzimlerin uzatılmasını ve etiketli nükleotitlerin eklenmesini içeren sentezin kullanılmasını içeriyordu.

Boles et al. ayrıca dijital mikroakışkan cihazlarda piro-sıralama üzerinde çalıştı. Damlacıkları oluşturmak, karıştırmak ve bölmek için bir elektro-ıslatma cihazı kullandılar. Sıralama, üç enzimli bir protokol ve manyetik boncuklarla sabitlenmiş DNA şablonları kullanır. Cihaz iki protokol kullanılarak test edildi ve ham pirogram seviyelerine dayalı olarak %100 doğrulukla sonuçlandı. Bu dijital mikroakışkan cihazların avantajları, boyut, maliyet ve ulaşılabilir fonksiyonel entegrasyon seviyelerini içerir.

Mikroakışkanları kullanan DNA dizileme araştırması , inDrops yöntemi gibi benzer damlacık mikroakışkan teknikleri kullanılarak RNA dizilenmesine de uygulanma yeteneğine sahiptir . Bu, bu DNA dizileme tekniklerinin birçoğunun daha fazla uygulanabileceğini ve genomlar ve transkriptomlar hakkında daha fazla şey anlamak için kullanılabileceğini göstermektedir.

Geliştirmedeki yöntemler

Şu anda geliştirilmekte olan DNA dizileme yöntemleri DNA şerit transit aracılığıyla diziyi okuma içerir nanopores (örneğin, katı-hal nanopores gibi ticari ancak sonraki nesillerin geliştirilmesi hala artık bir yöntem) ve bu şekilde mikroskopi tabanlı teknikler, atomik kuvvet mikroskopisi veya görsel algılama ve kayıt için daha ağır elementlerle (örn., halojenler) nükleotid etiketlemesi yoluyla uzun DNA fragmanları (>5.000 bp) içindeki tek tek nükleotitlerin pozisyonlarını belirlemek için kullanılan transmisyon elektron mikroskobu . Üçüncü nesil teknolojiler , aşırı reaktiflere olan ihtiyacı ortadan kaldırarak ve DNA polimerazın işlenebilirliğinden yararlanarak verimi artırmayı ve sonuç süresini ve maliyeti düşürmeyi amaçlar.

Tünel açma akımları DNA dizilimi

Başka bir yaklaşım, bir kanal boyunca hareket ederken tek iplikli DNA boyunca elektriksel tünelleme akımlarının ölçümlerini kullanır. Elektronik yapısına bağlı olarak her baz, tünelleme akımını farklı şekilde etkiler ve farklı bazlar arasında ayrım yapılmasına izin verir.

Tünelleme akımlarının kullanımı, büyüklük sıralarını iyonik akım yöntemlerinden daha hızlı sıralama potansiyeline sahiptir ve birkaç DNA oligomerinin ve mikro-RNA'nın dizilenmesi zaten başarılmıştır.

Hibridizasyon ile sıralama

Hibridizasyon yoluyla dizileme , bir DNA mikrodizisi kullanan enzimatik olmayan bir yöntemdir. Dizisi belirlenecek olan tek bir DNA havuzu, floresan olarak etiketlenir ve bilinen dizileri içeren bir diziye hibritlenir. Dizideki belirli bir noktadan gelen güçlü hibridizasyon sinyalleri, dizilenen DNA'daki dizisini tanımlar.

Bu dizileme yöntemi, bir hedef DNA dizisini yeniden yapılandırmak için aynı zamanda DNA probları olarak da adlandırılan kısa tek sarmallı DNA moleküllerinin (oligonükleotidler) bir kitaplığının bağlanma özelliklerini kullanır. Spesifik olmayan hibritler yıkama ile uzaklaştırılır ve hedef DNA ayrıştırılır. Melezler, DNA dizisi yeniden oluşturulabilecek şekilde yeniden düzenlenir. Bu sıralama türünün avantajı, homojen bir kapsama ile çok sayıda hedefi yakalama yeteneğidir. Genellikle çok sayıda kimyasal ve başlangıç ​​DNA'sı gereklidir. Ancak, çözüme dayalı hibridizasyonun ortaya çıkmasıyla birlikte çok daha az ekipman ve kimyasala ihtiyaç duyulmaktadır.

Kütle spektrometrisi ile sıralama

DNA dizilerini belirlemek için kütle spektrometrisi kullanılabilir. Matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon uçuş süresi kütle spektrometrisi veya MALDI-TOF MS , DNA fragmanlarını görselleştirmek için jel elektroforezine alternatif bir yöntem olarak özel olarak araştırılmıştır. Bu yöntemle, zincir sonlandırma dizileme reaksiyonları tarafından üretilen DNA fragmanları, büyüklük yerine kütle ile karşılaştırılır. Her nükleotidin kütlesi diğerlerinden farklıdır ve bu fark kütle spektrometrisi ile tespit edilebilir. Bir fragmandaki tek nükleotid mutasyonları, tek başına jel elektroforezinden ziyade MS ile daha kolay tespit edilebilir. MALDI-TOF MS, RNA fragmanları arasındaki farklılıkları daha kolay tespit edebilir, bu nedenle araştırmacılar, DNA'yı önce RNA'ya dönüştürerek MS tabanlı yöntemlerle dolaylı olarak sıralayabilir.

MS temelli yöntemlerle izin verilen DNA fragmanlarının daha yüksek çözünürlüğü, adli bilimdeki araştırmacılar için özel bir ilgi konusudur, çünkü bireyleri tanımlamak için insan DNA örneklerinde tek nükleotid polimorfizmleri bulmak isteyebileceklerdir . Bu numuneler oldukça bozulmuş olabilir, bu nedenle adli araştırmacılar , daha yüksek stabilitesi ve soy çalışmaları için uygulamaları için genellikle mitokondriyal DNA'yı tercih eder . Bir Federal Araştırma Bürosu veri tabanındaki örneklerden ve I. Dünya Savaşı askerlerinin toplu mezarlarında bulunan kemiklerden alınan insan mitokondriyal DNA dizilerini karşılaştırmak için MS tabanlı dizileme yöntemleri kullanılmıştır .

Erken zincir sonlandırma ve TOF MS yöntemleri, 100 baz çiftine kadar okuma uzunlukları gösterdi. Araştırmacılar bu ortalama okuma boyutunu aşamadı; tek başına zincir sonlandırma dizilimi gibi, MS tabanlı DNA dizilimi de büyük de novo dizileme projeleri için uygun olmayabilir . Öyle olsa bile, yakın tarihli bir çalışma, patojenik Streptococcus suşlarında tek nükleotid polimorfizmlerini karşılaştırmak için kısa dizi okumalarını ve kütle spektroskopisini kullandı .

Mikroakışkan Sanger dizilimi

Mikroakışkan Sanger dizilemesinde , DNA parçalarının tüm termodöngü amplifikasyonu ve bunların elektroforez ile ayrılması, tek bir cam gofret (yaklaşık 10 cm çapında) üzerinde yapılır, böylece reaktif kullanımı ve maliyeti azalır. Bazı durumlarda araştırmacılar, mikroçiplerin kullanımı yoluyla geleneksel dizilemenin verimini artırabileceklerini göstermiştir. Teknolojinin bu şekilde kullanımını etkili kılmak için hala araştırma yapılması gerekecektir.

Mikroskopi tabanlı teknikler

Bu yaklaşım, elektron mikroskobu kullanarak DNA moleküllerinin dizisini doğrudan görselleştirir. Artan atom numaralı atomları içeren modifiye bazların enzimatik olarak dahil edilmesiyle bozulmamış DNA molekülleri içindeki DNA baz çiftlerinin ilk tanımlanması, sentetik bir 3,272 baz çifti DNA molekülü ve bir 7,249 baz çifti viral genomu içindeki ayrı ayrı etiketlenmiş bazların doğrudan görselleştirilmesi ve tanımlanması Gösterildi.

RNAP dizilimi

Bu yöntem, bir polistiren boncuğuna bağlanan RNA polimerazın (RNAP) kullanımına dayanmaktadır . Dizilenecek DNA'nın bir ucu, her iki boncuk da optik tuzaklara yerleştirilerek başka bir boncukla bağlanır. Transkripsiyon sırasındaki RNAP hareketi, boncukları yakınlaştırır ve daha sonra tek bir nükleotid çözünürlüğünde kaydedilebilen göreceli mesafe değişikliklerini getirir. Dizi, Sanger yöntemine benzer şekilde, dört nükleotid tipinin her birinin azaltılmış konsantrasyonları ile dört okumaya dayalı olarak çıkarılır. Bölgeler arasında bir karşılaştırma yapılır ve bilinen dizi bölgeleri ile bilinmeyen dizi bölgeleri karşılaştırılarak dizi bilgisi çıkarılır.

In vitro virüs yüksek verimli dizileme

454 pyrosequencing ve bir in vitro virüs mRNA görüntüleme yönteminin bir kombinasyonunu kullanarak protein etkileşimlerinin tam setlerini analiz etmek için bir yöntem geliştirilmiştir . Spesifik olarak, bu yöntem ilgili proteinleri onları kodlayan mRNA'lara kovalent olarak bağlar ve ardından ters transkripsiyon PCR'lerini kullanarak mRNA parçalarını tespit eder . mRNA daha sonra amplifiye edilebilir ve sekanslanabilir. Birleşik yöntem IVV-HiTSeq olarak adlandırılmıştır ve sonuçları in vivo koşulları temsil etmese de hücresiz koşullar altında gerçekleştirilebilir .

örnek hazırlama

Herhangi bir DNA dizileme protokolünün başarısı, ilgili biyolojik materyalden DNA veya RNA numunesinin çıkarılmasına ve hazırlanmasına bağlıdır.

  • Başarılı bir DNA ekstraksiyonu, uzun, bozulmamış ipliklere sahip bir DNA örneği verecektir.
  • Başarılı bir RNA ekstraksiyonu, ters transkriptaz kullanılarak tamamlayıcı DNA'ya (cDNA) dönüştürülmesi gereken bir RNA örneği verecektir - PCR benzeri bir şekilde mevcut RNA ipliklerine dayalı tamamlayıcı bir DNA sentezleyen bir DNA polimeraz. Tamamlayıcı DNA daha sonra genomik DNA ile aynı şekilde işlenebilir.

Kullanılacak dizileme teknolojisine göre, DNA veya RNA ekstraksiyonundan elde edilen numuneler daha fazla hazırlık gerektirir. Sanger dizileme için, dizilemeden önce klonlama prosedürleri veya PCR gereklidir. Yeni nesil dizileme yöntemleri söz konusu olduğunda, işlemeden önce kitaplık hazırlığı gereklidir. Hem ekstraksiyondan sonra hem de kütüphane hazırlığından sonra nükleik asitlerin kalitesini ve miktarını değerlendirmek, bozulmuş, parçalanmış ve düşük saflıkta numuneleri tanımlar ve yüksek kaliteli sıralama verileri verir.

Mevcut DNA/RNA dizileme teknolojilerinin yüksek verimli doğası, numune hazırlama yönteminin ölçeğini büyütmesi için bir zorluk oluşturmuştur. Daha düşük toplam uygulama süresi ile daha fazla sayıda numunenin hazırlanması için çeşitli sıvı işleme aletleri kullanılmaktadır:

şirket Sıvı işleyiciler / Otomasyon low_mark_USD üst_mark_USD Landing_url
Opentronlar OpenTrons OT-2 5.750$ 20.000$ https://www.opentrons.com/
Gilson Gilson Pipetmax 20.000$ 40.000 $ https://gb.gilson.com/GBSV/system-pipetmax.html
Neotek Neotec EzMate 25.000 ABD Doları 45.000 $ http://neotec.co.il/pipetting-device/
formül matrisi Formulatrix Mantis 40.000 $ 60.000$ https://formulatrix.com/liquid-handling-systems/mantis-liquid-handler/
Hudson Robotik Hudson Robotik YALNIZCA 40.000 $ 50.000$ https://hudsonrobotics.com/products/applications/automated-solutions-next-generation-sequencing-ngs/
Hamilton Hamilton Microlab NIMBUS 40.000 $ 80.000 dolar https://www.hamiltoncompany.com/automated-liquid-handling/platforms/microlab-nimbus#specations
TTP Laboratuvar Teknolojisi TTP Labtech Sivrisinek HV Genomik 45.000 $ 80.000 dolar https://www.sptlabtech.com/products/liquid-handling/mosquito-hv-genomics/
Beckman Coulter Biomek 4000 50.000$ 65.000 $ https://www.mybeckman.uk/liquid-handlers/biomek-4000/b22640
Hamilton Hamilton Genomik YILDIZ 50.000$ 100.000$ https://www.hamiltoncompany.com/automated-liquid-handling/assay-ready-workstations/genomic-starlet
ependorf Eppendorf epMotion 5075t 95.000 $ 110.000 $ https://www.eppendorf.com/epmotion/
Beckman Coulter Beckman Coulter Biomek i5 100.000$ 150.000$ https://www.beckman.com/liquid-handlers/biomek-i5
Hamilton Hamilton NGS YILDIZI 100.000$ 200.000$ http://www.hamiltonrobotics.com/
PerkinElmer PerkinElmer Sciclone G3 NGS ve NGSx İş İstasyonu 150.000$ 220.000$ https://www.perkinelmer.com/uk/product/sciclone-g3-ngs-workstation-cls145321
çevik Agilent Bravo NGS 170.000 $ 290.000 $ https://www.agilent.com/en/products/automated-liquid-handling/automated-liquid-handling-applications/bravo-ngs
Beckman Coulter Beckman Coulter Biomek i7 200.000$ 250.000$ https://www.beckman.com/liquid-handlers/biomek-i7
Laboratuvar Eko 525 Beckman Coulter Labsit Yankı 525 260.000$ 300.000 $ https://www.labcyte.com/products/liquid-handling/echo-525-liquid-handler
Tekan Tekan NGS 270.000$ 350.000 $ https://lifesciences.tecan.com/ngs-sample-preparation

Geliştirme girişimleri

NHGRI tarafından hesaplandığı gibi, zaman içinde bir insan genomunu dizilemenin toplam maliyeti .

Ekim 2006'da, X Prize Foundation , Archon X Prize adlı tam genom dizileme teknolojilerinin geliştirilmesini teşvik etmek için "bir cihaz inşa edebilen ve onu 100 insan genomunu dizilemek için kullanabilen ilk Takıma" 10 milyon dolar vermeyi amaçlayan bir girişim kurdu. 10 gün veya daha kısa sürede, dizilenen her 100.000 bazda bir hatadan fazla olmayan bir doğrulukla, diziler genomun en az %98'ini doğru bir şekilde kapsayan ve genom başına 10.000 ABD Dolarından (ABD) fazla olmayan bir tekrarlayan maliyetle."

Her yıl Ulusal İnsan Genomu Araştırma Enstitüsü veya NHGRI, yeni araştırma ve gelişmeler için hibe teşvik genomik . 2010 hibeleri ve 2011 adayları arasında mikroakışkan, polonya ve baz ağırlıklı sıralama metodolojilerinde devam eden çalışmalar yer alıyor.

hesaplama zorlukları

Burada açıklanan dizileme teknolojileri, tam genomlar ( dizi montajı ) gibi daha uzun diziler halinde birleştirilmesi gereken ham verileri üretir . Bu tür programların ve gibi algoritmalar tarafından yapılır ham sekans verileri değerlendirilirken olarak bunu başarmak için birçok hesaplama zorlukları vardır phred ve PHRAP . Diğer zorluklar, genomun birçok yerinde meydana geldikleri için genellikle tam genom gruplarını önleyen tekrarlayan dizilerle uğraşmak zorundadır . Sonuç olarak, birçok dizi belirli kromozomlara atanmayabilir . Ham dizi verilerinin üretimi, ayrıntılı biyoinformatik analizinin yalnızca başlangıcıdır . Yine de sıralama ve sıralama hatalarını düzeltmek için yeni yöntemler geliştirildi.

Kırpmayı oku

Bazen, sıralayıcı tarafından üretilen ham okumalar, uzunluklarının yalnızca bir kısmında doğru ve kesindir. Tüm okumanın kullanılması, genom montajı, SNP çağrısı veya gen ekspresyonu tahmini gibi akış aşağı analizlerde yapaylıklar ortaya çıkarabilir. Pencere tabanlı veya çalışan toplam algoritma sınıflarına dayalı olarak iki sınıf kırpma programı tanıtılmıştır. Bu, şu anda mevcut olan kırpma algoritmalarının, ait oldukları algoritma sınıfını belirten kısmi bir listesidir:

Kırpma Algoritmalarını Okuyun
Algoritmanın adı Algoritma türü Bağlantı
Cutadapt Çalışan toplam Cutadapt
ConDeTri Pencere tabanlı ConDeTri
ERNE-FİLTRE Çalışan toplam ERNE-FİLTRE
FASTX kaliteli düzeltici Pencere tabanlı FASTX kaliteli düzeltici
PRINSEQ Pencere tabanlı PRINSEQ
trimmomatik Pencere tabanlı trimmomatik
SolexaQA Pencere tabanlı SolexaQA
SolexaQA-BWA Çalışan toplam SolexaQA-BWA
Orak Pencere tabanlı Orak

Etik konular

İnsan genetiği, 1970'lerin başından beri biyoetik alanına dahil edilmiştir ve DNA dizilemesinin (özellikle yüksek verimli dizileme) kullanımındaki büyüme, bir dizi etik sorunu ortaya çıkarmıştır. Önemli bir konu, bir bireyin DNA'sının mülkiyeti ve bu DNA dizilendiğinde üretilen verilerdir. Bu konuyla ilgili önde gelen yasal dava olan DNA molekülünün kendisi ile ilgili olarak, California Üniversitesi'nden Moore v. Regents (1990), bireylerin atılan hücreler veya bu hücreler kullanılarak elde edilen herhangi bir kâr (örneğin, patentli olarak) üzerinde mülkiyet haklarının olmadığına karar verdi. hücre hattı ). Bununla birlikte, bireylerin hücrelerin çıkarılması ve kullanılması konusunda bilgilendirilmiş onam alma hakkı vardır. Moore , DNA dizilemesi yoluyla üretilen verilerle ilgili olarak , bireye DNA'larından türetilen bilgiler üzerinde hiçbir hak vermez.

DNA dizileme daha yaygın hale geldikçe, genomik verilerin saklanması, güvenliği ve paylaşımı da daha önemli hale geldi. Örneğin, bir endişe, sigortacıların, bireyin DNA'larına dayalı olarak algılanan gelecekteki sağlığına bağlı olarak, tekliflerini değiştirmek için bireyin genomik verilerini kullanabilmeleridir. Mayıs 2008'de, Amerika Birleşik Devletleri'nde, sağlık sigortası ve istihdam ile ilgili olarak genetik bilgi temelinde ayrımcılığı yasaklayan Genetik Bilgi Ayrımcılık Yasağı Yasası (GINA) imzalandı. 2012 yılında, ABD Başkanlık Biyoetik Sorunları Araştırma Komisyonu , GINA ve Sağlık Sigortası Taşınabilirlik ve Hesap Verebilirlik Yasası gibi DNA dizileme verileri için mevcut gizlilik mevzuatının yetersiz olduğunu bildirerek, tüm genom dizileme verilerinin özellikle hassas olduğunu belirtti. yalnızca verinin oluşturulduğu kişiyi değil, aynı zamanda akrabalarını da tanımlamak için kullanılabilir.

Amerika Birleşik Devletleri'nin çoğunda, yalanmış bir damga veya zarf, kahve fincanı, sigara, sakız, ev çöpü veya halka açık bir kaldırıma düşen saç gibi "terk edilmiş" DNA yasal olarak toplanabilir. ve polis, özel dedektifler, siyasi muhalifler veya babalık anlaşmazlıklarına karışan kişiler de dahil olmak üzere herkes tarafından sıralanır. 2013 itibariyle, on bir eyalette "DNA hırsızlığını" yasaklayacak şekilde yorumlanabilecek yasalar bulunmaktadır.

23andMe gibi şirketler tarafından hem yenidoğanlarda hem de yetişkinlerde genetik varyasyon taramasının artan kullanımıyla etik sorunlar da gündeme geldi . Genetik varyasyon taramasının zararlı olabileceği ve hastalık riskinin yüksek olduğu tespit edilen bireylerde kaygıyı artırabileceği iddia edildi. Örneğin, Time'da belirtilen bir vakada , genetik varyantlar için hasta bir bebeği tarayan doktorlar, ebeveynlere vereceği zarar nedeniyle, bunama ile bağlantılı alakasız bir varyant hakkında ebeveynleri bilgilendirmemeyi seçti . Bununla birlikte, The New England Journal of Medicine'de 2011 yılında yapılan bir araştırma, hastalık risk profiline giren bireylerin artan kaygı düzeyleri göstermediğini göstermiştir.

Ayrıca bakınız

Notlar

Referanslar

Dış bağlantılar