Mutajenez (moleküler biyoloji tekniği) - Mutagenesis (molecular biology technique)
Olarak moleküler biyoloji , mutajenez ve böylece önemli laboratuar tekniğidir DNA mutasyonlarının kasıtlı olan işlenmiş üretmek için kütüphanelerin , mutant gen, protein, bakterilerin ya da diğer suşlarının genetik olarak değiştirilmiş organizmalar . Bir genin çeşitli bileşenleri, düzenleyici elemanları ve gen ürünleri, bir genetik lokusun, sürecin veya ürünün işleyişinin ayrıntılı olarak incelenebilmesi için mutasyona uğratılabilir. Mutasyon, ilginç özelliklere sahip mutant proteinler veya ticari kullanımda olabilecek geliştirilmiş veya yeni işlevler üretebilir. Pratik uygulamaya sahip olan veya belirli bir hücre fonksiyonunun moleküler temelinin araştırılmasına izin veren mutant suşlar da üretilebilir.
Günümüzde birçok mutajenez yöntemi mevcuttur. Başlangıçta, laboratuvarda yapay olarak indüklenen mutasyon türleri, UV ışınlaması gibi mekanizmalar kullanılarak tamamen rastgele idi. Rastgele mutajenez, genomun belirli bölgelerini veya dizilerini hedefleyemez; ancak bölgeye yönelik mutajenezin geliştirilmesiyle daha spesifik değişiklikler yapılabilir. 2013'ten bu yana, prokaryotik bir viral savunma sistemine dayanan CRISPR /Cas9 teknolojisinin geliştirilmesi, bir genomun in vivo olarak düzenlenmesine veya mutajenezine izin verdi . Sahaya yönelik mutajenezin, rastgele mutajenezin olmadığı durumlarda faydalı olduğu kanıtlanmıştır. Diğer mutajenez teknikleri, kombinatoryal ve eklemeli mutajenezi içerir. Rastgele olmayan mutajenez, DNA klonlamak, mutajenlerin etkilerini araştırmak ve protein mühendisliği yapmak için kullanılabilir. Ayrıca bağışıklığı baskılanmış hastalara yardım etme, HIV ve kanser dahil olmak üzere hastalıkların araştırılması ve tedavisi ve beta talasemi gibi hastalıkların tedavisi gibi tıbbi uygulamalara da sahiptir .
rastgele mutajenez
Mutajeneze yönelik ilk yaklaşımlar, tamamen rastgele mutasyonlar üreten yöntemlere dayanıyordu. Bu tür yöntemlerde, hücreler veya organizmalar UV radyasyonu veya mutajenik kimyasallar gibi mutajenlere maruz bırakılır ve daha sonra istenen özelliklere sahip mutantlar seçilir. Hermann Muller o 1927 yılında keşfedilen röntgen genetik mutasyonlara neden olabilir meyve sinekleri ve o yaptığı çalışmalar için oluşturulan mutantlar kullanmak gitti genetik . İçin Escherichia coli , mutantlar daha sonra, bir agar ortamı üzerine kaplanmıştır UV radyasyonuna maruz bırakılarak ilk seçilebilir. Oluşan koloniler daha sonra biri zengin bir ortamda , diğeri minimal bir ortamda olmak üzere replika-plakalanır ve spesifik beslenme gereksinimlerine sahip mutantlar daha sonra minimal ortamda büyüyememeleri ile tanımlanabilir. Benzer prosedürler, diğer hücre türleri ve seçim için farklı ortamlar ile tekrarlanabilir.
Daha sonra ilginç veya gelişmiş özelliklere sahip mutantları taramak için belirli proteinlerde rastgele mutasyonlar oluşturmak için bir dizi yöntem geliştirildi. Bu yöntemler, oligonükleotit sentezinde katkılı nükleotitlerin kullanımını veya örneğin replikasyonun aslına uygunluğunu azaltarak veya nükleotit analoglarını kullanarak nükleotitlerin yanlış birleşmesini artıran (hataya eğilimli PCR) koşullarda bir PCR reaksiyonunun yürütülmesini içerebilir. Bir gende yanlı olmayan mutasyonları entegre etmek için bu yöntemin bir varyasyonu, dizi doygunluğu mutagenezidir . Mutasyon(lar) içeren PCR ürünleri daha sonra bir ekspresyon vektörüne klonlanır ve üretilen mutant proteinler daha sonra karakterize edilebilir.
Hayvan çalışmalarında, mutant fareler oluşturmak için N -etil- N- nitrosourea (ENU) gibi alkilleyici maddeler kullanılmıştır. Etil metansülfonat (EMS) genellikle hayvan, bitki ve virüs mutantları oluşturmak için kullanılır.
Bir Avrupa Birliği yasasında (2001/18 direktifi gibi), bu tür mutajenez GDO üretmek için kullanılabilir, ancak ürünler düzenlemeden muaftır: etiketleme yok, değerlendirme yok.
Bölgeye yönelik mutagenez
Geliştirme sahasına yönelik mutajenez tekniklerinden önce, yapılan tüm mutasyonlar rastgeleydi ve bilim adamları, istenen mutasyonu bulmak için istenen fenotip için seçimi kullanmak zorundaydı. Rastgele mutajenez teknikleri, kaç tane mutasyon üretilebileceği açısından bir avantaja sahiptir; bununla birlikte, rastgele mutajenez, tek nükleotidlerde bir değişiklik üretebilirken, hangi nükleotidin değiştirildiği konusunda fazla kontrol sağlamaz. Bu nedenle birçok araştırmacı, DNA'ya seçilen değişiklikleri kesin, bölgeye özgü bir şekilde dahil etmeye çalışır. İlk denemeler nükleotidlerin analoglarını kullanır ve diğer kimyasallar ilk olarak lokalize nokta mutasyonları oluşturmak için kullanılmıştır . Bu gibi kimyasal maddeler, aminopürin bir AT GC'ye indükler geçiş nitrosoguanidin, ise, bisülfit , ve N 4 -hydroxycytidine AT geçiş GC indükleyebilir. Bu teknikler, belirli mutasyonların bir proteine dönüştürülmesine izin verir; bununla birlikte, üretilen mutantların türleri açısından esnek değildirler ve daha sonraki bölgeye yönelik mutajenez yöntemleri kadar spesifik değildirler ve bu nedenle bir dereceye kadar rastgeleliğe sahiptirler. DNA'nın kromozom üzerindeki belirli bölgelerde parçalanması, yeni nükleotidlerin eklenmesi ve baz çiftlerinin değiş tokuşu gibi diğer teknolojiler, mutasyonların nereye gidebileceğine karar vermek artık mümkün.
Bölgeye özgü mutasyon için mevcut teknikler, 1978'de geliştirilen primer uzatma tekniğinden kaynaklanmaktadır. Bu tür teknikler, yaygın olarak, DNA polimeraz ile bir primer uzatma reaksiyonunda önceden imal edilmiş mutajenik oligonükleotitlerin kullanılmasını içerir . Bu yöntemler , belirli bölgelerdeki küçük DNA uzantılarının nokta mutasyonuna veya silinmesine veya eklenmesine izin verir . Metodolojideki ilerlemeler, bu tür mutajenezi artık nispeten basit ve verimli bir süreç haline getirmiştir.
Bölgeye yönelik mutajenezin daha yeni ve daha verimli yöntemleri sürekli olarak geliştirilmektedir. Örneğin, "Dikişsiz ligasyon klonlama özü" (veya kısaca SLiCE) adı verilen bir teknik, genom içindeki belirli DNA dizilerinin klonlanmasına izin verir ve genoma aynı anda birden fazla DNA parçası eklenebilir.
Bölgeye yönelik mutajenez, spesifik mutasyonun etkisinin araştırılmasına izin verir. Çok sayıda kullanım vardır; örneğin, belirli türlerin laboratuvarlarda sıklıkla kullanılan kimyasallara ne kadar duyarlı olduğunu belirlemek için kullanılmıştır. Deney, spesifik kimyasalın beklenen mutasyonlarını taklit etmek için bölgeye yönelik mutajenezi kullandı. Mutasyon, spesifik amino asitlerde bir değişikliğe neden oldu ve bu mutasyonun etkileri analiz edildi.
Alana yönelik yaklaşım , bir proteinin yapısı veya işlevi için önemli kalıntıları tanımlamak için kalıntıların sistematik olarak alanine mutasyona uğratıldığı alanin tarama mutagenezi gibi tekniklerde sistematik olarak yapılabilir . Bir başka kapsamlı yaklaşım, bir kodonun veya bir dizi kodonun , spesifik pozisyonlarda tüm olası amino asitlerle ikame edilebildiği bölge doygunluk mutajenezidir .
kombinatoryal mutajenez
Kombinatoryal mutajenez, bir proteinin birden fazla mutantının, ilave bireysel mutasyonların etkilerinin analizine dayalı olarak aynı anda tasarlanabildiği, sahaya yönelik bir protein mühendisliği tekniğidir. Çok sayıda mutasyonun protein fonksiyonu üzerindeki kombinatoryal etkisini değerlendirmek için faydalı bir yöntem sağlar. Çok sayıda mutant, kombinatoryal analiz ile belirli bir karakteristik için taranabilir. Bu teknikte, bir DNA zinciri boyunca çoklu pozisyonlar veya kısa sekanslar, kapsamlı bir mutant protein kütüphanesi elde etmek için kapsamlı bir şekilde modifiye edilebilir. Yararlı varyantların görülme oranı, mutajenez kitaplıkları oluşturmak için farklı yöntemlerle geliştirilebilir. Bu tekniğe bir yaklaşım, DNA dizisinin bir bölümünü, istenen mutasyon bölgesindeki tüm olası kombinasyonları içeren bir dizi kitaplığı ile çıkarmak ve değiştirmektir. Eklenen segmentin içeriği, yapısal öneme sahip diziler, immünojenik özellik veya enzimatik fonksiyon içerebilir. Bir proteinin belirli bir bölümünün yapısal veya fonksiyonel önemini değerlendirmek için gene rastgele bir segment de eklenebilir.
ekleme mutajenez
DNA mutasyonlarına neden olan bir veya daha fazla baz çiftinin eklenmesi, aynı zamanda yerleştirme mutajenezi olarak da bilinir. Bunlar gibi tasarlanmış mutasyonlar, kanser araştırmalarında, hastalığın gelişimine ilişkin mekanik anlayışlar gibi önemli bilgiler sağlayabilir. Retrovirüsler ve transpozonlar, yerleştirme mutajenezinde başlıca araçsal araçlardır. Fare meme tümörü virüsü ve murin lösemi virüsü gibi retrovirüsler, karsinogenezde yer alan genleri tanımlamak ve spesifik kanserlerin biyolojik yollarını anlamak için kullanılabilir. Transpozonlar, transpozisyona uğrayabilen kromozomal segmentler, kanser geni keşfi için bir araç olarak ekleme mutajenezine tasarlanabilir ve uygulanabilir. Bu kromozomal segmentler, DNA dizilemesinde daha kapsamlı, tarafsız derinlik sağlarken, hemen hemen her dokuya ekleme mutagenezinin uygulanmasına izin verir.
Araştırmacılar, insanlarda kullanılabilecek dört eklemeli mutajenez mekanizması buldular. ilk mekanizmaya geliştirici ekleme denir. Arttırıcılar, o genin bir promotörü ile etkileşime girerek belirli bir genin transkripsiyonunu arttırır. Bu özel mekanizma ilk olarak, kemik iliğine ihtiyacım olan ciddi bağışıklığı baskılanmış hastalara yardım etmek için kullanıldı. Güçlendiriciler taşıyan gammatrovirüsler daha sonra hastalara yerleştirildi. İkinci mekanizma, promotör yerleştirme olarak adlandırılır. Destekleyiciler, hücrelerimize çeviriyi başlatmak için gereken belirli dizileri sağlar. Promoter yerleştirme, araştırmacıların HIV virüsü hakkında daha fazla bilgi edinmesine yardımcı oldu. Üçüncü mekanizma, gen inaktivasyonudur. Gen inaktivasyonuna bir örnek, lösemi hastalarında T hücresinin genomunu bozan bir retrovirüs eklemek için ekleme mutajenezi kullanmak ve onlara T hücrelerinin kanser hücrelerini hedeflemesine izin veren CAR adı verilen spesifik bir antijen vermektir. Nihai mekanizmalar, mRNA 3' uç ikamesi olarak adlandırılır. Genlerimiz ara sıra, kırmızı kan hücresi fonksiyonunu kesintiye uğratan beta-talasemiye neden olan nokta mutasyonlarına uğrar. Bu sorunu çözmek için kırmızı kan hücreleri için doğru gen dizisi verilir ve bir ikame yapılır.
homolog rekombinasyon
Homolog rekombinasyon , bir organizmada spesifik mutasyon üretmek için kullanılabilir. Modifiye edilecek gene benzer DNA dizilimi içeren vektör hücreye verilir ve bir rekombinasyon işlemi ile kromozomdaki hedef genin yerini alır. Bu yöntem, örneğin nakavt farelerin üretiminde kullanıldığı gibi, bir mutasyonu dahil etmek veya bir geni nakavt etmek için kullanılabilir .
CRISPR
2013'ten bu yana, CRISPR -Cas9 teknolojisinin geliştirilmesi, çok çeşitli organizmaların genomuna farklı mutasyon türlerinin verimli bir şekilde dahil edilmesini sağlamıştır. Yöntem bir transpozon yerleştirme bölgesi gerektirmez, hiçbir işaret bırakmaz ve verimliliği ve basitliği onu genom düzenleme için tercih edilen yöntem haline getirmiştir .
gen sentezi
DNA oligonükleotid sentezinin maliyeti düştükçe, tam bir genin yapay sentezi artık bir gene mutasyonları dahil etmek için uygun bir yöntemdir. Bu yöntem, belirli bir organizma için onu optimize etmek için bir genin kodon kullanımının tamamen yeniden tasarlanması dahil olmak üzere, birden fazla bölgede kapsamlı mutasyona izin verir.
Ayrıca bakınız
Referanslar
Dış bağlantılar
|
Mutajenez hakkında kütüphane kaynakları |