Çok açılı ışık saçılması - Multiangle light scattering

Çok açılı ışık saçılımı (MALS), bir numune tarafından çok sayıda açıya saçılan ışığı ölçmek için bir tekniği açıklar. Işığın nasıl dağıldığını tespit ederek, çözeltideki moleküllerin hem mutlak molar kütlesini hem de ortalama boyutunu belirlemek için kullanılır . Bir lazer kaynağından gelen paralel ışık en sık kullanılır, bu durumda teknik çok açılı lazer ışık saçılımı (MALLS) olarak adlandırılabilir. "Lazer" kelimesinin eklenmesi, Hg-ark lambaları gibi geleneksel ışık kaynaklarıyla ışık saçılımı ölçümleri yapmaya alışkın olanlara artık düşük açılı ölçümlerin yapılabileceğine dair güvence vermeyi amaçlıyordu. Lazerlerin ve bunlarla ilişkili dar genişlikteki ince ışınların ortaya çıkışına kadar, bu tür ölçümleri yapmak için kullanılan geleneksel ışık ışınlarının genişliği, daha küçük saçılma açılarında veri toplanmasını engelledi. Son yıllarda, tüm ticari ışık saçılım enstrümantasyonları lazer kaynakları kullandığından, ışık kaynağından bahsetme ihtiyacı ortadan kalktı ve MALS terimi baştan sona kullanıldı.

"Çok açılı" terimi, örneğin, seçilen belirli açıları içeren bir aralık üzerinde hareket ettirilen tek bir dedektör veya belirli açısal konumlara sabitlenmiş bir dizi dedektör tarafından ölçüldüğü gibi farklı ayrık açılarda saçılan ışığın algılanmasını ifade eder. Bazı uygulamalar, veri analiz yöntemleri ve bunlarla bağlantılı grafik temsiller dahil olmak üzere bu statik ışık saçılmasıyla ilgili fiziksel fenomenin bir tartışması sunulmaktadır.

Arka plan

Aydınlatılmış bir numuneden saçılan ışığın ölçümü, klasik ışık saçılımı ölçümünün temelini oluşturur . Tarihsel olarak, bu tür ölçümler, aydınlatılmış numune etrafında bir yay içinde döndürülen tek bir dedektör kullanılarak yapılmıştır. İlk ticari alet (resmi olarak "dağınık fotometre" olarak adlandırılır) 1950'lerin ortalarında tanıtılan Brice-Phoenix ışık saçılım fotometresiydi ve bunu 1960'ların sonlarında tanıtılan Sofica fotometre izledi.

Ölçümler genellikle saçılan yoğunluklar veya saçılan ışınım olarak ifade edildi. Verilerin toplanması, dedektör ark üzerinde farklı konumlara yerleştirildiğinde yapıldığından, her konum farklı bir saçılma açısına karşılık geldiğinden, ilgilenilen her açısal konuma ayrı bir dedektör yerleştirme kavramı, ticari olarak uygulanmamasına rağmen iyi anlaşıldı. 1970'lerin sonlarında. Farklı kuantum verimliliğine sahip çoklu dedektörlerin farklı tepkileri vardır ve bu nedenle bu şemada normalleştirilmesi gerekir. Yüksek hızlı filmin kullanımına dayanan ilginç bir sistem, 1974'te Brunsting ve Mullaney tarafından geliştirildi. Bu, saçılan yoğunlukların tüm aralığının , göreli saçılma yoğunluklarını sağlayan sonraki bir yoğunluk ölçer taramasıyla film üzerine kaydedilmesine izin verdi . Tek bir detektörün sonra konvansiyonel kullanımı belirli açılarda toplanan yoğunlukları denilen bir şekilde aydınlatılan numune etrafında döndürülerek diferansiyel ışık saçma kuantum mekanik terimi sonra ayırıcı kesiti , σ (θ) mili ahırlarda ifade / steradyan. Diferansiyel kesit ölçümleri, örneğin, atom çekirdeğinin yapısını, onlardan nötronlar gibi nükleonları saçarak incelemek için yaygın olarak yapıldı . Her ikisi de baş harfleri DLS ile ifade edilen diferansiyel ışık saçılımı ile dinamik ışık saçılımı arasında ayrım yapmak önemlidir . İkincisi, yapıcı ve yıkıcı girişim nedeniyle saçılan ışığın dalgalanmasını, termal harekete bağlı frekansı , çözelti veya süspansiyondaki moleküllerin veya parçacıkların Brownian hareketini ölçen oldukça farklı bir tekniğe atıfta bulunur .

Bir MALS ölçümü, bir dizi yardımcı eleman gerektirir. Bunların arasında en önemlisi , örneğin bir bölgesini aydınlatan , paralelleştirilmiş veya odaklanmış bir ışık demetidir (genellikle bir lazer kaynağından, paralelleştirilmiş bir monokromatik ışık demeti üretir). Modern cihazlarda, ışın genellikle ölçüm düzlemine dik düzlem-polarizedir, ancak özellikle anizotropik parçacıklar incelenirken diğer polarizasyonlar kullanılabilir. Daha önceki ölçümler, lazerlerin piyasaya sürülmesinden önce, Hg-ark lambaları gibi kaynaklardan gelen odaklanmış, ancak polarize olmayan ışık ışınları kullanılarak yapıldı. Bir diğer gerekli eleman, ölçülmekte olan numuneyi tutmak için bir optik hücredir. Alternatif olarak, akan numunelerin ölçülmesine izin vermek için araçlar içeren hücreler kullanılabilir. Tek parçacıkların saçılma özellikleri ölçülecekse, bu tür parçacıkların ışık huzmesi yoluyla çevredeki detektörlerden genellikle eşit uzaklıkta bir noktada birer birer sokulması için bir araç sağlanmalıdır.

MALS temelli ölçümlerin çoğu, aydınlatıcı ışının içinden geçtiği merkezi bir örnekten genellikle eşit uzaklıkta yerleştirilmiş bir dizi dedektör içeren bir düzlemde gerçekleştirilse de, dedektörlerin bir kürenin yüzeyinde bulunduğu üç boyutlu versiyonlar da geliştirilmiştir. numunenin, kürenin bir çapı boyunca geçen gelen ışık demetinin yolunu kestiği merkezinden geçmesi kontrol edilir. İlk çerçeve aerosol partiküllerini ölçmek için kullanılırken, ikincisi fitoplankton gibi deniz organizmalarını incelemek için kullanıldı .

Geleneksel diferansiyel ışık saçılımı ölçümü, şu anda kullanılan MALS tekniği ile hemen hemen aynıydı. MALS tekniği genellikle bir dizi ayrık detektörün çıktılarından ardışık olarak çoğullanmış veri toplamasına rağmen, daha önceki diferansiyel ışık saçılımı ölçümü, tek bir dedektör bir toplama açısından diğerine hareket ettiğinden verileri sırayla toplamıştır. MALS uygulaması elbette çok daha hızlıdır, ancak aynı tür veriler toplanır ve aynı şekilde yorumlanır. Böylece iki terim aynı kavramı ifade eder. Diferansiyel ışık saçılımı ölçümleri için, ışık saçan fotometre tek bir detektöre sahipken, MALS ışık saçan fotometre genellikle çok sayıda detektöre sahiptir.

Başka bir MALS cihazı türü 1974 yılında Salzmann ve diğerleri tarafından geliştirilmiştir. George ve diğerleri tarafından icat edilen bir ışık düzeni detektörüne dayalıdır. 1971'de Litton Systems Inc. için. Litton dedektörü, film saydamlarına kaydedilen nesnelerin geometrik ilişkileri ve spektral yoğunluk dağılımını örneklemek için küresel bir merceğin arka odak düzlemindeki ışık enerjisi dağılımını örneklemek için geliştirilmiştir .

Litton dedektörünün Salzman ve diğerleri tarafından uygulanması. 0° ile 30° arasındaki 32 küçük saçılma açısında ve en önemli açılar statik ışık saçılımı için ileri açılar olduğundan geniş bir azimut açıları aralığında ortalama ölçüm sağladı. 1980 yılına kadar Bartholi ve ark. 2.5° ≤ θ ≤ 177.5° aralığında 30 kutup açısında 2.1° çözünürlükle ölçüme izin vermek için eliptik bir reflektör kullanarak ayrı saçılma açılarında saçılımı ölçmek için yeni bir yaklaşım geliştirmişti.

Çok açılı sistemlerin ticarileştirilmesi 1977'de Science Spectrum, Inc.'in USFDA için geliştirilmiş özelleştirilmiş bir biyo-tahlil sistemi için bir akışlı kapiler sistemin patentini almasıyla başladı . 8 ayrık dedektör içeren ilk ticari MALS cihazı , 1983 yılında Wyatt Technology Company tarafından SC Johnson ve Son'a teslim edildi ve bunu 1984 yılında AMOCO'ya ilk 15 dedektör akış cihazının (Dawn-F) satışı ile takip etti. 1988'de, tek aerosol parçacıklarının saçılma özelliklerini ölçmek için özel olarak üç boyutlu bir konfigürasyon tanıtıldı. Aynı zamanda, tek fitoplanktonun saçılan ışık özelliklerini ölçmek için su altı cihazı inşa edildi. Sinyaller optik fiberler tarafından toplandı ve bireysel fotoçoğaltıcılara iletildi. Aralık 2001 civarında, bir CCD dedektörü (BI-MwA: Brookhaven Instruments Corp, Hotlsville, NY) kullanılarak 7 saçılma açısını ölçen bir alet ticarileştirildi .

MALS fotometreleri tarafından yapılan ölçümlerle ilgili literatür kapsamlıdır. hem partiküllerin/moleküllerin toplu ölçümlerine hem de boyut dışlama kromatografisi (SEC), ters faz kromatografisi (RPC) ve alan akış fraksiyonasyonu (FFF) gibi kromatografik araçlarla fraksiyonlamanın ardından yapılan ölçümlere atıfta bulunur .

teori

Çok açılı konumlarda yapılan saçılma ölçümlerinin yorumlanması, ölçülen parçacıkların veya moleküllerin a priori özelliklerine ilişkin bazı bilgilere dayanır. Bu tür saçıcıların farklı sınıflarının saçılma özellikleri, uygun bir teorinin uygulanmasıyla en iyi şekilde yorumlanabilir. Örneğin, aşağıdaki teoriler en sık uygulanır.

Rayleigh saçılması en basit olanıdır ve gelen dalga boyundan çok daha küçük nesneler tarafından ışığın veya diğer elektromanyetik radyasyonun elastik saçılımını tanımlar. Bu saçılma türü gün boyunca gökyüzünün mavi renginden sorumludur ve dalga boyunun dördüncü kuvveti ile ters orantılıdır.

Rayleigh-Gans yaklaşımı dağıtıcı partıkuller bir kırılma indeksine sahip olduğu varsayımına ile MALS ölçümleri yorumlanması için bir araçtır , n _{, 1} , çok yakın kırılma indisi çevreleyen ortamın, bir n, ₀ . m = n ₁ /n _{0 olarak} ayarlarsak ve |m - 1| << 1 ise , bu tür parçacıkların her biri bir Rayleigh saçılım parçacığı olarak temsil edilebilen çok küçük öğelerden oluştuğu düşünülebilir. Böylece daha büyük parçacığın her küçük elemanının diğerlerinden bağımsız olarak saçıldığı varsayılır.

Lorenz-Mie teorisi, ışığın homojen küresel parçacıklar tarafından saçılmasını yorumlamak için kullanılır. Rayleigh–Gans yaklaşımı ve Lorenz–Mie teorisi, |1 − m | → 0 .

Lorenz-Mie teorisi, referans başına küresel simetrik parçacıklara genelleştirilebilir. Daha genel şekiller ve yapılar Erma tarafından işlenmiştir.

Saçılma verileri genellikle, taşıyıcı sıvının kendisinin Rayleigh oranı ve varsa diğer arka plan katkılarının çıkarıldığı çözeltinin veya tek parçacık olayının Rayleigh oranı olarak tanımlanan aşırı Rayleigh oranı olarak temsil edilir. Bir açı ile uzanan bir detektör ölçülen Rayleigh Oranı İçeride ISTV melerin RWMAIWi'nin ve raptederek , bir katı açı ΔΩ , birim olayı yoğunluğu başına ışık birimi başına katı açının yoğunluğu olarak tanımlanır I ₀ , birim hacimde saçılma ışıklı ΔV . Saçılan ışığın dedektöre ulaştığı saçılma hacmi ΔV , dedektörün genellikle açıklıklar, lensler ve duraklarla sınırlandırılan görüş alanı tarafından belirlenir. Şimdi, bir lazer tarafından üretilen ince bir ışık huzmesiyle aydınlatılan ml başına N özdeş parçacık/molekül süspansiyonundan bir düzlemde yapılan bir MALS ölçümünü düşünün. Işığın dedektörlerin düzlemine dik polarize olduğunu varsayarsak. Dedektör tarafından θ açısında ölçülen saçılan ışık yoğunluğu , askıda kalan sıvı tarafından saçılandan fazla olacaktır.

${\displaystyle I(\theta )={\frac {I_{0}N\Delta V}{(kr)^{2}}}i(\theta )}$,

burada i(θ) tek bir parçacığın saçılma fonksiyonudur, k = 2πn ₀ /λ ₀ , n ₀ askıda kalan sıvının kırılma indisidir ve λ ₀ gelen ışığın vakum dalga boyudur. Fazla Rayleigh oranı, R(θ) , daha sonra şu şekilde verilir:

${\displaystyle R(\theta )={\frac {I(\theta )r^{2}}{I_{0}\Delta V}}=Ni(\theta )/k^{2}}$.

Kırılma indisi, n, asılı sıvının kırılma indisi "n ₀ " ile hemen hemen aynı olan , yani Rayleigh-Gans yaklaşımına çok yakın olan a yarıçaplı basit bir homojen küre için bile , saçılma düzlemindeki saçılma fonksiyonu nispeten karmaşıktır. miktar

${\displaystyle i(\theta )={\frac {k^{2}V^{2}\left|{m-1}\right|^{2}}{4\pi ^{2}}}G ^{2}\left({2ka\sin {\frac {\theta }{2}}}\sağ)}$, nerede

${\displaystyle G(\xi )={\frac {3}{\xi ^{2}}}(\sin \xi -\xi \cos \xi )}$,    ,    ${\displaystyle k={\frac {2\pi n_{0}}{\lambda _{0}}}}$${\displaystyle V={\frac {4}{3}}\pi a^{3}}$

ve λ ₀ , vakumda gelen ışığın dalga boyudur.

Uygulamalar

Zimm arsa ve toplu toplama

MALS en yaygın olarak çözeltideki moleküllerin kütle ve boyutunun karakterizasyonu için kullanılır. Bu tür tarafından ele alınanlar gibi, MALS erken uygulamaları Bruno H. Zimm onun kağıt “cihaz ve ölçüm ve ışık saçılımı açısal olarak değiştirilmesinin yorumlanması için Yöntemler; Polistiren Çözeltilerine İlişkin Ön Sonuçlar” şeffaf bir kap içinde bulunan bir numune etrafında döndürülen tek bir dedektörün kullanılmasını içeriyordu. Bunun gibi akmayan numunelerden alınan MALS ölçümlerine genellikle "parti ölçümleri" denir. Bilinen birkaç düşük konsantrasyonda numuneler oluşturarak ve numune etrafında değişen açılarda saçılan ışığı tespit ederek, aşağıdakileri çizerek bir Zimm grafiği oluşturulabilir: - burada c numunenin konsantrasyonudur ve k , kc'yi ve içine koymak için kullanılan bir germe faktörüdür . aynı sayısal aralık. ${\displaystyle {\frac {K^{*}c}{R_{\theta}}}}$${\displaystyle \sin ^{2}{\frac {\theta}{2}}+kc}$${\displaystyle \sin ^{2}{\frac {\theta}{2}}}$

Çizildiğinde, hem sıfır açı hem de sıfır konsantrasyon için ekstrapolasyon yapılabilir ve çizimin analizi, c=0 çizgisinin ilk eğiminden örnek moleküllerin ortalama kare yarıçapını ve her ikisinin de olduğu noktada molekülün molar kütlesini verecektir. konsantrasyon ve açı sıfıra eşittir. Genel olarak “küresel uyum” olarak adlandırılan, toplanan tüm verileri içeren Zimm grafiğindeki iyileştirmeler, modern toplu analizlerde Zimm grafiğinin yerini büyük ölçüde almıştır.

SEC ve akış modu

Boyut dışlama kromatografisinin (SEC) ortaya çıkmasıyla birlikte , MALS ölçümleri, kalibrasyon tekniklerine bağlı olmaktan ziyade mutlak molar kütleyi ve kolondan ayrılan numune fraksiyonlarının boyutunu belirlemek için çevrimiçi bir konsantrasyon detektörü ile birlikte kullanılmaya başlandı. Bu akış modu MALS ölçümleri, alan akış fraksiyonasyonu , iyon değişim kromatografisi ve ters fazlı kromatografi gibi diğer ayırma tekniklerine genişletildi .

Işık saçılım verilerinin açısal bağımlılığı, aşağıda SEC ile ayrılmış polistiren kürelerin bir karışımı şeklinde gösterilmektedir. En küçük iki örnek (en sağda) en son elute edildi ve açısal bağımlılık göstermedi. Sağdan ikinci örnek, yoğunluğun daha düşük saçılma açılarında arttığı doğrusal bir açısal varyasyonu göstermektedir. Soldaki en büyük örnek önce ayrıştırılır ve doğrusal olmayan açısal varyasyon gösterir.

MALS Ölçümlerinin Faydası

Molar kütle ve boyut

MALS'yi SEC gibi bir numune ayırma aracını takip eden bir hat içi konsantrasyon dedektörü ile birleştirmek, elute edilen numunenin molar kütlesinin hesaplanmasına ve bunun yanı sıra kök-ortalama-kare yarıçapına izin verir. Aşağıdaki şekil, BSA agregatlarının kromatografik bir ayrımını temsil eder. Bir MALS detektöründen gelen 90° ışık saçılım sinyali ve her bir elüsyon dilimi için molar kütle değerleri gösterilmektedir.

moleküler etkileşimler

MALS, moleküllerin molar kütlesini ve boyutunu sağlayabildiği için, protein-protein bağlanması, oligomerizasyon ve kendi kendine birleşme, birleşme ve ayrışma kinetiği üzerinde çalışmaya izin verir. Bir numunenin molar kütlesini konsantrasyonuyla karşılaştırarak, etkileşime giren moleküllerin bağlanma afinitesi ve stokiyometrisi belirlenebilir.

Dallanma ve moleküler konformasyon

Bir polimerin dallanma oranı, rastgele dallanmış bir polimerdeki dal birimlerinin sayısı ve yıldız dallı polimerlerdeki kolların sayısı ile ilgilidir ve Zimm ve Stockmayer tarafından şu şekilde tanımlanmıştır:

${\displaystyle g={\frac {R_{b}^{2}}{R_{l}^{2}}}}$

Aynı molar kütlelere sahip dallanmış ve doğrusal makromoleküllerin ortalama kare yarıçapı nerededir . MALS'yi yukarıda açıklandığı gibi bir konsantrasyon detektörü ile birlikte kullanarak, molar kütleye karşı yarıçap-ortalama kare kökünün bir log-log grafiği oluşturulur. Bu grafiğin eğimi, dallanma oranını g verir. ${\ Displaystyle R^{2}}$

Dallanmaya ek olarak, boyutun molar kütleye karşı log-log grafiği, bir makromolekülün şeklini veya konformasyonunu gösterir. Grafiğin eğimindeki bir artış, bir polimerin konformasyonunda küreselden rastgele bobine ve doğrusaldan bir değişime işaret eder. MALS'den elde edilen ortalama kare yarıçapı, DLS ölçümlerinden elde edilen hidrodinamik yarıçap ile birleştirmek, her makromoleküler boyut fraksiyonu için ρ = şekil faktörünü verir . ${\görüntüleme stili r_{h}}$${\displaystyle {\frac {r_{g}}{r_{h}}}}$

Diğer uygulamalar

Diğer MALS uygulamaları arasında nanoparçacık boyutlandırma, protein agregasyon çalışmaları, protein-protein etkileşimleri , elektroforetik hareketlilik veya zeta potansiyeli yer alır. Farmasötik ilaç stabilitesi ve nanotıpta kullanım çalışmaları için MALS teknikleri benimsenmiştir .

Referanslar