Alan akışı fraksiyonasyonu - Field flow fractionation

Kanal içindeki laminer akışın hızının eşit olmadığı akış alanı-akış fraksiyonasyonu (AF4) kanal kesiti. Akışkan, duvarlardan kanalın merkezine doğru uzaklaştıkça artan akış hızı ile parabolik bir düzende hareket eder. Ayırma, kanalın birikme (alt) duvarına yakın bir yerde gerçekleşir.

Alan akışı fraksiyonasyonu , kısaltılmış FFF , durağan bir fazı olmayan bir ayırma tekniğidir. Seyreltik çözeltiler veya çözünen maddenin süspansiyonları üzerinde çalıştığı için sıvı kromatografisine benzer. Ayırma, uzun ve dar bir kanaldan pompalanan numunenin taşınma yönüne dik bir alan (hidrolik, merkezkaç, termal, elektrik, manyetik, yerçekimi,...) uygulanarak sağlanır. Alan, numune bileşenleri üzerinde, onları biriktirme duvarı olarak adlandırılan kanal duvarlarından birine doğru yoğunlaştıran bir kuvvet uygular. Kuvvet, numunenin bir özelliği ile etkileşir, bu durumda ayırma gerçekleşir, başka bir deyişle, alan tarafından uygulanan kuvvet altında onların farklı "hareketleri" ile. Örnek olarak, hidrolik veya çapraz akışlı FFF yöntemi için, ayırmayı sağlayan özellik, öteleme difüzyon katsayısı veya hidrodinamik boyuttur. Bir termal alan için (bir duvarı ısıtmak ve diğerini soğutmak), termal ve öteleme difüzyon katsayısının oranıdır.

Uygulamalar ve algılama yöntemleri

FFF, "normal" modda alt mikron aralığında (1 nm'den birkaç mikrona kadar) veya sterik mod olarak adlandırılan modda 50 mikrona kadar uygulanabilir. Normal moddan sterik moda geçiş, bir mikronun üzerindeki boyutlarda difüzyon ihmal edilebilir hale geldiğinde gerçekleşir. FFF, hem çözünür makromolekülleri hem de tek bir analizde ayrılabilen partikülleri veya kolloidleri kapsayan geniş dinamik boyut aralığında benzersizdir.

Tipik uygulamalar, yüksek molar kütleli polimerler ve polimer kompozitler, hem endüstriyel hem de çevresel nano partiküller, virüsler ve virüs benzeri partiküller, lipid nanopartiküller, hücre dışı veziküller ve diğer biyolojik numune türleridir.

FFF, HPLC veya SEC'den bilinen tüm dedektör tiplerine bağlanabilir. FFF'nin Sıvı Kromatografisine benzerliği nedeniyle, sıvı mobil fazın kanaldan geçmesi bakımından en yaygın dedektörler LC için de kullanılanlardır. En sık kullanılanı, tahribatsız doğası nedeniyle bir UV dedektörüdür. Çok açılı ışık saçılımı ile birleştirme , ayrıştırılan fraksiyonların boyutunu hesaplamaya ve FFF teorisi ile elde edilen değerlerle karşılaştırmaya olanak tanır. Bir başka popüler spesifik saptama, metalik nanoparçacıkları yüksek özgüllük ve hassasiyetle karakterize etmek için Endüktif olarak eşleştirilmiş plazma kütle spektrometrisidir .

Avantajlar

FFF, Boyut dışlama kromatografisi gibi diğer ayırma yöntemleriyle potansiyel olarak karakterize edilemeyen karmaşık ve homojen olmayan numunelerin fiziksel olarak ayrılmasını sağlar . Durağan faz olmadığı için yüzeyler veya kolon dolgu malzemesi ile daha az etkileşim vardır. Ayırma, ayırma alanının gücü modüle edilerek ayarlanabilir. FFF nazik bir yöntemdir ve kırılgan numuneler üzerinde fiziksel stres uygulamaz ve taşıyıcı çözelti, en iyi numune stabilitesi göz önünde bulundurularak uyarlanabilir. FFF, bir dizi deneme-yanılma deneyi olmadan ayırma koşullarını bulmak ve en uygun sonuca ulaşmak için kullanılabilecek iyi işlenmiş bir teoriye sahiptir. Numune fraksiyonlarının fiziksel parametrelerinin bilgilerini FFF teorisinden çıkarmak da mümkündür, ancak hemen hemen tüm kullanıcılar, ayrıştırılan numune fraksiyonlarının boyutunu ölçmek için ışık saçılım dedektörlerine bağımlıdır.

sınırlamalar

FFF, hızlı difüzyonları nedeniyle küçük moleküller için çalışmaz. Etkili bir ayırma için, numunenin biriktirme duvarına çok yakın (10 µm'den daha az bir mesafe) konsantre edilmesi gerekir, bu da kuvvet alanının neden olduğu sürüklenme hızının difüzyon katsayısına kıyasla iki büyüklük mertebesi daha yüksek olmasını gerektirir. Bir FFF kanalında üretilebilecek maksimum alan gücü, daha düşük boyuttaki ayırma aralığını belirler. Mevcut enstrümantasyon için bu yaklaşık 1 nm'dir.

FFF son derece çok yönlü bir teknik olmasına rağmen, tüm uygulamalar için "herkese uyan tek bir boyut" yöntemi yoktur. Farklı FFF yöntemleri özel enstrümantasyona ihtiyaç duyar. Şu anda sadece asimetrik akış alan-akış fraksiyonasyonu (AF4) olarak adlandırılan geniş bir kullanım alanı kazanmıştır. Santrifüj, termal veya elektriksel FFF gibi diğer yöntemlerin hala bir niş varlığı vardır.

FFF, kolon kromatografisinden farklı davranır ve HPLC veya SEC kullanıcıları için sezgisel olabilir. FFF'nin çalışma prensibinin anlaşılması, yöntemin başarılı bir şekilde uygulanması için hayati önem taşımaktadır.

Keşif ve genel ilkeler

FFF, 1966 yılında J. Calvin Giddings tarafından geliştirilmiş ve ilk kez yayınlanmıştır ve 1976 yılında günümüzün en önemli FFF tekniği olan Flow-FFF'i yayınlamıştır. FFF'nin icadıyla tanınan Giddings, Utah Üniversitesi'nde kimya profesörü ve kromatografi ve ayırma teknikleri uzmanıydı .

Medya oynat

Animasyon, FFF'deki ayırmanın, parabolik bir akış profilinde parçacık difüzyonu tarafından nasıl yönlendirildiğini gösterir. Gösterilen iki tür parçacıktır; kırmızı olanlar mavi olanlardan daha küçüktür. Yukarıdan bir kuvvet uygulanır (burada asimetrik akışta kullanılan bir çapraz akıştır fff). Parçacıklar bu kuvvete karşı yayılır. Ortalama olarak, daha küçük kırmızı parçacıklar, mavi parçacıklara kıyasla biriktirme duvarının yukarısındadır. Uzunlamasına yöndeki elüsyon akışı, hız profilini gösteren akış oklarıyla gösterilmiştir. Daha yükseğe sıçrayan parçacıklar diğerlerine göre daha hızlı taşınır. Birçok parçacığın istatistiksel sürecinde ve birçok difüzyon adımında, kırmızı, daha küçük parçacıkların oluşturduğu bulut daha hızlı hareket eder ve daha yavaş olan mavi parçacıklardan ayrılır.

Yukarıda sözü edildiği gibi, alan akışlı ayırma işleminde alan olabilir hidrolik (enine olan akış , birikim duvar gibi bir yarı-geçirgen membrandan) yerçekimi , santrifüj , ısı , elektriksel veya manyetik . Her durumda, ayırma mekanizması, difüzyon kuvvetleriyle sabit bir dengede , alan kuvvetleri altında parçacık hareketliliğindeki farklılıklar tarafından üretilir: Alan, birikim duvarına doğru aşağı doğru bir sürüklenme hızı ve konsantrasyonu indükler, difüzyon buna karşı çalışır. konsantrasyon gradyanı. Belirli bir süre sonra (gevşeme süresi denir) iki kuvvet durağan bir dengede dengelenir. Bu, en iyi şekilde, tüm bileşenlerin sürekli hareket halinde olduğu, ancak ortalama konsantrasyonda üstel bir azalmanın birikim duvarından kanala doğru gittiği bir parçacık bulutu olarak görselleştirilir. Deniz seviyesinden yukarı çıkan hava basıncının azalması, Barometrik formülde açıklanan üstel azalmanın aynısına sahiptir . Gevşeme sağlandıktan sonra kanal akışı aktive edildiğinde elüsyon başlar. İnce kanalda (tipik yükseklik 250 ila 350 um) , birikim duvarından artan mesafe ile akış hızında güçlü bir artış ile karakterize edilen bir parabolik laminer-akış -hız profili mevcuttur. Bu, kanalın duvarından denge konumuna bağlı olarak belirli bir parçacığın hızını belirler. Biriktirme duvarına daha yakın olan parçacıklar, daha yüksekte olan diğer parçacıklara kıyasla daha yavaş göç edecektir. Bir parçacık türünün hızının sıvının ortalama hızına oranına , tutma oranı R denir . FFF'de verimli ayırma için R'nin 0,2'nin altında olması gerekir, tipik değerler 0,02 ila 0,1 aralığındadır.

teori ve yöntem

Alan akışı fraksiyonasyonunda ayırma bir kanalda gerçekleşir. Bir ara parça ile ayrılan bir üst ve alt bloktan oluşur. Ara parçası bloklar arasında sızdırmaz hale geldiğinde kanal hacmini oluşturan bir oyuğa (dikdörtgen veya yamuk) sahiptir. Alternatif olarak kanal, bir boşluk olarak üst bloğa frezelenebilir. Kanal, kuvvet alanının uygulanmasına izin verecek şekilde tasarlanmıştır, bu da her FFF yöntemi için özel bir kanal gerektiği anlamına gelir. Numune kanala seyreltik bir solüsyon veya süspansiyon içinde enjekte edilir ve taşıyıcı solüsyon kanaldan pompalanırken girişten çıkışa geçiş sırasında ayrılır. Kanal çıkışının aşağı akışına, ayrıştırma fraksiyonlarını analiz eden bir veya birkaç dedektör yerleştirilir.

Giddings ve çalışma arkadaşları, tüm FFF yöntemlerinde ortak olan genel alıkoyma denklemini açıklayan bir teori geliştirdiler.

Kuvvet (F) ile tutma süresi (t _r ) arasındaki _ilişki

Ayırıcı kuvvet alanı ve tutma süresi arasındaki ilişki, ilk ilkelerden türetilebilir. FFF kanalı içindeki iki parçacık popülasyonunu düşünün. Çapraz alan, her iki parçacık bulutunu da alttaki "birikim" duvarına doğru sürer. Bu kuvvet alanının karşısında, bir karşı hareket hareketi üreten parçacıkların doğal difüzyonu veya Brownian hareketi bulunur. Bu iki taşıma işlemi dengeye ulaştığında, partikül konsantrasyonu c, denklem ( 1 )' de gösterildiği gibi, birikim duvarının üzerindeki x yüksekliğinin üstel fonksiyonuna yaklaşır .

${\displaystyle c=c_{0}e^{\frac {-x}{\ell }}}$

( 1 )

${\görüntüleme stili\el }$parçacık bulutunun karakteristik yüksekliğini temsil eder. Bu, parçacık bulutunun kanal içinde ulaştığı ortalama yükseklikle ilgilidir ve yalnızca parçacık popülasyonları için değer farklı olduğunda ayrışma meydana gelecektir. Her bir bileşenin tek tek her bir parçacık veya difüzyon katsayısı D oranına ve sürüklenme hızının uygulanan kuvvet ile ilgili olabilir A.B.D. ${\görüntüleme stili\el }$${\görüntüleme stili\el }$

${\displaystyle \ell ={\frac {kT}{F}}={\frac {D}{U}}}$

( 2 )

k, Boltzmann sabitidir, T mutlak sıcaklıktır ve F, kuvvet alanı tarafından tek bir parçacığa uygulanan kuvvettir. Bu, karakteristik yükseklik değerinin uygulanan kuvvete nasıl ters bağlı olduğunu gösterir. Bu nedenle, F ayırma sürecini yönetir. Bu nedenle, alan kuvveti değiştirilerek, optimum seviyelere ulaşmak için ayırma kontrol edilebilir.

Bir molekül bulutunun hızı V, basitçe bir parabolik akış profiline gömülü üstel dağılımın ortalama hızıdır.

Alıkonma süresi, t _r şu şekilde yazılabilir:

${\displaystyle t_{r}={\frac {L}{V}}}$

( 3 )

Burada L, kanal uzunluğudur.

FFF'de alıkoyma genellikle alıkoyma oranı cinsinden ifade edilir; bu, boşluk süresi t ₀ (tutulmamış bir izleyicinin ortaya çıkışı) bölü tutma süresi t _r . Tutma denklemi daha sonra şöyle olur:

${\displaystyle R={\frac {t_{0}}{t_{r}}}=6\lambda [\operatöradı {coth} ({\frac {1}{2\lambda }})-2\lambda ] }$

( 4 )

nerede w ile bölünür, kanal kalınlığı veya yüksekliği. Yerine kT/F'nin değiştirilmesi, uygulanan çapraz kuvvete göre tutma oranını gösterir. ${\ Displaystyle \ lambda }$${\görüntüleme stili\el }$${\görüntüleme stili\el }$

${\displaystyle R=6{\frac {kT}{Fw}}[\coth({\frac {Fw}{2kT}})-2{\frac {kT}{Fw}}]}$

( 5 )

Verimli bir çalışma için, kanal kalınlık değeri w, çok aşıyor . Bu durumda parantez içindeki terim birliğe yaklaşır. Bu nedenle, denklem 5 şu şekilde tahmin edilebilir: ${\görüntüleme stili\el }$

${\displaystyle R=6\lambda =6{\frac {kT}{Fw}}}$

( 6 )

Dolayısıyla t _r , F ile kabaca orantılıdır. Tutma sürelerinde sonlu artış ∆t _{r ile} temsil edilen X ve Y parçacık bantlarının ayrılması, yalnızca aralarındaki kuvvet artışı ∆F yeterliyse sağlanır. Bunun olması için sadece 10 ^–16 N'lik yürürlükte olan bir diferansiyel gereklidir.

F ve ∆F'nin büyüklüğü partikül özelliklerine, alan kuvvetine ve alan tipine bağlıdır. Bu, tekniğin varyasyonlarına ve uyarlamalarına izin verir. Bu temel ilkeden, uygulanan ayırma kuvvetinin doğasına ve hedeflendikleri molekül boyutu aralığına göre değişen birçok FFF formu evrimleşmiştir.

Fraktogram

Santrifüj FFF kütleye göre ayrılır (yani partikül yoğunluğu ve partikül boyutunun bir kombinasyonu). Örneğin, aynı boyuttaki altın ve gümüş nanoparçacıkları, altın ve gümüşün yoğunluğundaki farklılıklara göre iki tepe noktasına ayrılabilir.

FFF'de detektör sinyallerinin zamanın bir fonksiyonu olarak gösterilmesine, kolon kromatografi tekniklerinin kromatogramının aksine fraktogram denir. Fraktogram, FFF teorisi ve/veya detektör sinyalleri kullanılarak analitin bir veya birkaç fiziksel özelliğinin bir dağılım grafiğine dönüştürülebilir. Bu boyut, molar kütle, yük vb. olabilir.

Genellikle bu maddeler, başlangıçta küçük bir sıvı tampon hacminde süspanse edilen ve tampon tarafından FFF kanalı boyunca itilen parçacıklardır. Belirli bir parçacık türünün değişen hızları, boyutuna, kütlesine ve/veya düzgün olmayan akış hızına sahip bir kanalın duvarlarından uzaklığına bağlı olabilir. Böylece, bir numunede farklı türlerin varlığı, uzun kanalın aşağısında belirli bir mesafede ortak bir özelliğin saptanması yoluyla ve elde edilen fraktogram ile, çeşitli türlerin varlığını tepe noktalarına göre gösteren, farklı varış zamanları özelliğinden dolayı belirlenebilir. her tür ve fiziksel ve kimyasal özellikleri.

Formlar

Bugün mevcut olan tekniklerin çoğu, yaklaşık 40 yıl önce Prof. Giddings tarafından orijinal olarak yaratılanların ilerlemeleridir.

simetrik akış

Bu tekniklerden akış FFF, ticari olarak sunulan ilk tekniktir. Flow FFF, yoğunluktan bağımsız olarak partikülleri boyuta göre ayırır ve 1 nm ila 1 µm aralığındaki makromolekülleri ölçebilir. Bu açıdan mevcut en çok yönlü FFF alt tekniğidir. Flow FFF'deki çapraz akış, kanalın tepesindeki gözenekli bir frit içinden girer ve biriktirme çeperi (yani alt cidar) üzerindeki yarı geçirgen bir membran çıkış fritinden çıkar. Son yirmi yılda simetrik akış yerini asimetrik akışa bırakmıştır.

İçi boş elyaf akışı

İçi boş elyaf akışı FFF (HF5), Lee ve diğerleri tarafından geliştirilmiştir . (1974). HF5, proteinlerin ve diğer makromoleküllerin analizine yönelik olarak uygulanmıştır. HF5, 1974'te geliştirilen ilk akış FFF biçimiydi. Avantajı, HF5'in rutin uygulamalarda kolayca değiştirilebilen tek kullanımlık bir kanal birimi sunmasıdır. HF5'in dezavantajlarından biri, sınırlı membran malzemesi seçimidir; sadece polieter sülfon (PES) membranlar mevcuttur. Şu anda, HF5, esneklik eksikliği ve örnek yükündeki sınırlamalar nedeniyle yaygın olarak kullanılmamaktadır.

asimetrik akış

Asimetrik akış FFF ( AF4 ) ise kanalın alt duvarında yalnızca bir yarı geçirgen zara sahiptir. Bu nedenle çapraz akış, kanalın altından çıkan taşıyıcı sıvı tarafından yaratılır. Bu, son derece hassas bir ayırma ve "ultra geniş" bir ayırma aralığı sunar. Kullanılan FFF cihazlarının çoğu AF4 sistemleridir. Ana uygulamalar, proteinler, virüs ve virüs benzeri parçacıklar ve lipozomlar için farmasötik araştırma ve geliştirmedir. AF4, sulu ve organik çözücülerde uygulanabilir, bu nedenle organik polimerler de bu teknikle ayrılabilir.

Yüksek Sıcaklık Asimetrik Akış Alan Akış Fraksiyonasyonu, 150 C'nin üzerindeki sıcaklıklarda çözünen yüksek ve ultra yüksek molar kütleli polimerlerin ayrılması için mevcuttur.

termal

Termal FFF, adından da anlaşılacağı gibi, kanala bir sıcaklık gradyanı uygulayarak bir ayırma kuvveti oluşturur. Üst kanal duvarı ısıtılır ve alt duvar soğutulur, polimerler ve partiküller termal difüzyon ile soğuk duvara doğru sürülür. Termal FFF, organik çözücülerde sentetik polimerleri ayırmak için bir teknik olarak geliştirilmiştir. Termal FFF, makromolekülleri hem molar kütleye hem de kimyasal bileşime göre ayırabilmesi ve aynı moleküler ağırlığa sahip polimer fraksiyonlarının ayrılmasına izin vermesi bakımından FFF teknikleri arasında benzersizdir. Bugün bu teknik, polimerlerin, jellerin ve nanopartiküllerin karakterizasyonu için idealdir.

Termal FFF'nin en büyük avantajlarından biri, termal FFF kalibrasyon sabitleri sıradan (moleküler) difüzyon oranını yakından tanımladığı için laboratuvarlar arası veya cihazlar arası Evrensel Kalibrasyon'u mümkün kılan ayırma kanalının basit ve çok iyi tanımlanmış boyutlarıdır. D katsayısı ile termal difüzyon katsayısı (veya termoforetik hareketlilik) D _T sadece polimere bağlıdır. Bu nedenle, ThFFF Evrensel Kalibrasyon, cihaz ve laboratuvardan aktarılabilirken, iyi bilinen boyut dışlama kromatografisi Evrensel Kalibrasyon, yalnızca aynı cihazda polimerden aktarılabilir.

Bölünmüş akış ince hücre fraksiyonasyonu

Bölünmüş akışlı ince hücre fraksiyonasyonu (SPLITT), µm boyutlu parçacıkların sürekli olarak ayrılması için yerçekimi kullanan özel bir hazırlayıcı FFF tekniğidir. SPLITT, sıvı içeren numuneyi kanalın başlangıcında üst girişe pompalarken, aynı anda alt girişe bir taşıyıcı sıvı pompalayarak gerçekleştirilir. İki giriş akışının ve iki çıkış akışının akış oranı oranlarını kontrol ederek, ayırma kontrol edilebilir ve numune iki farklı boyutlu fraksiyona ayrılabilir. Ayırma kuvveti olarak tek başına yerçekiminin kullanılması, SPLITT'i 1 µm'nin üzerindeki partiküllerle sınırlı olan en az hassas FFF tekniği yapar.

Merkezkaç

Merkezkaç FFF'de, ayırma alanı bir merkezkaç kuvveti ile oluşturulur. Kanal, çalışma sırasında programlanabilen dönüş hızlarında dönen bir halka şeklini alır. Akış ve numune kanala pompalanır ve santrifüjlenir, böylece operatörün partikülleri kütleye (boyut ve yoğunluk) göre çözmesi sağlanır. Santrifüj FFF'nin avantajı, uygulanan kuvvetin değiştirilmesiyle elde edilebilen yüksek boyut çözünürlüğünde yatmaktadır, çünkü parçacık boyutu parçacık kütlesi ile üçüncü güce orantılıdır.

Santrifüjlü FFF tarafından sunulan benzersiz avantaj, yeterli boyant yoğunluğu verilen yüksek çözünürlük için tekniklerin yeteneğinden gelir. Bu, partiküllerin sadece %5'lik bir boyut farkıyla ayrılmasını sağlar.

Santrifüj FFF, partiküllerin ve makromoleküllerin sadece partikül boyutundan ziyade partikül yoğunluğuna göre ayrılabilme avantajına sahiptir. Bu durumda, altın ve gümüş nanoparçacıklarındaki yoğunluk farklılıklarına göre, aynı boyutta iki altın ve gümüş nanoparçacık iki tepe noktasına ayrılabilir.

AF4 ayrımlarında kütlenin zamana oranı 1:1'dir. Santrifüj FFF'ye üçüncü yoğunluk parametresinin eklenmesiyle, bu, kütle:zamana üçün gücüne daha çok benzeyen bir oran üretir. Bu, tepe noktaları arasında önemli ölçüde daha büyük bir ayrım ile sonuçlanır ve büyük ölçüde geliştirilmiş bir çözünürlük ile sonuçlanır. Bu, kompozit malzemeler ve nanopartiküller içeren kaplanmış polimerler gibi yeni ürünler için özellikle faydalı olabilir, yani boyut olarak değişmeyen fakat yoğunluk olarak değişen partiküller. Bu şekilde, aynı boyuttaki iki parçacık, yoğunluğun farklı olması koşuluyla, iki tepe noktasına ayrılabilir.

Yöntemin sınırlaması, numunenin yoğunluğuna bağlı olan alt boyut sınırında yatmaktadır. Spesifik olarak biyolojik numuneler için sınır, çap olarak 20 ila 50 nm mertebesindedir.

Elektriksel

Elektriksel FFF'de, bir elektrik alanı oluşturan enine bir elektrik akımı (DC) uygulanır. Numune bileşenlerinin yüküne bağlı olarak, bir elektroforetik sürüklenme hızı indüklenir, Brownian hareketinden difüzyonla karşılanır, bu nedenle ayrılma, elektroforetik hareketlilik ve boyut oranına bağlıdır. Elektrik FFF uygulaması sınırlıdır ve şu anda nadiren kullanılmaktadır. Özel bir alternatif akımın uygulandığı çevrimsel elektriksel FFF gibi diğer modifikasyonlar geliştirilmiştir. Elektroforetik mobiliteye göre ayrılmasını sağlar. Diğer bir varyasyon, bir çapraz akış alanına ek olarak bir elektrik alanının uygulandığı elektriksel asimetrik akış FFF'dir (EAF4). EAF4, zayıf çözünürlüğe sahip olan ve kanal çıkışını kirleten ve dedektör sinyallerini tehlikeye atan elektroliz ürünleri ve kabarcıklardan muzdarip olan saf elektrik FFF sınırlamasının üstesinden gelir.

Referanslar

Dış bağlantılar

• Roda, A. (2005). "Multianalit İmmünoanalizlerine Doğru: Kemilüminesans Tespiti ile Akış Destekli, Katı Faz Formatı" . Klinik Kimya . 51 (10): 1993–1995. doi : 10.1373/clinchem.2005.053108 . ISSN  0009-9147 .