Taramalı iyon iletkenlik mikroskobu - Scanning ion-conductance microscopy
Taramalı iyon iletkenlik mikroskobu ( SICM ), prob ucu olarak bir elektrot kullanan bir taramalı prob mikroskopisi tekniğidir . SICM, elektrolitleri ileten sulu ortamdaki mikrometre ve hatta nanometre aralığındaki yapıların yüzey topografyasının belirlenmesine izin verir. Numuneler sert veya yumuşak olabilir, genellikle iletken değildir ve ölçümün tahribatsız doğası, canlı doku ve hücrelerin ve genel olarak biyolojik numunelerin gözlemlenmesine olanak tanır.
Numunelerdeki dik profil değişikliklerini tespit edebilir ve canlı bir hücrenin sertliğini ayrıntılı topografyasıyla birlikte haritalamak veya hücrelerin göçleri sırasında hareketliliğini belirlemek için kullanılabilir.
Çalışma prensibi
Taramalı iyon iletkenlik mikroskobu, elektrolit içeren bir sulu ortamdaki bir mikro-pipette zayıf iletken bir yüzeye yaklaştığında erişim direncinin artmasını kullanan bir tekniktir. Mikro/nano-pipetin içine ve dışına akan iyonik akımı izler; bu, uç numune yüzeyine çok yakınsa engellenir, çünkü iyonların akabileceği boşluk boyut olarak küçülür.
SICM kurulumu genel olarak şu şekildedir: Biri cam mikro pipette ve diğeri toplu çözeltide bulunan iki Ag/AgCl elektrotu arasına bir voltaj uygulanır. Voltaj, mikro pipete giren ve çıkan iki elektrot arasında iyonik bir akım üretecektir. İki elektrot arasındaki iletkenlik ölçülür ve iyon akışına bağlıdır.
Pipetin hareketleri piezoelektrik ile düzenlenir .
Mikro pipet, iyon akışı kısıtlanmaya başlayana kadar numuneye daha yakın ve daha yakın bir yere indirilir. Sistemin iletkenliği daha sonra azalacak (ve direnç artacaktır). Bu direnç belirli bir eşiğe ulaştığında uç durdurulur ve pozisyon kaydedilir. Daha sonra uç hareket ettirilir (kullanılan moda bağlı olarak farklı şekillerde, aşağıya bakın) ve farklı bir konumda başka bir ölçüm yapılır ve bu böyle devam eder. Sonunda, tüm ölçümlerin konumlarının karşılaştırılması, numunenin ayrıntılı bir yükseklik profilini sağlar.
Numune ile temas etmeden önce ucun durdurulduğuna dikkat etmek önemlidir, bu nedenle SICM'nin en büyük avantajlarından biri olan gözlemlenen yüzeye bükülmez veya zarar vermez.
Eşdeğer devre
Kurulumun toplam direnci (Rtot), üç direncin toplamıdır: Rb, Rm ve Rt. Mikro pipetin ucu ile çözeltinin kütlesindeki elektrot arasındaki elektrolit çözeltisinin direncini Rb. Rm, mikro pipetteki elektrot ile uç arasındaki elektrolit çözeltisinin direncidir. Rt, uçtan geçen akımın direncidir.
Rb ve Rm, elektrolit iletkenliğine ve Ag/AgCl elektrotlarının konumu ve şekline bağlıdır. Rt, açıklığın boyutuna ve şekline ve uç ile numune arasındaki mesafeye bağlıdır.
Uç ve numune arasındaki mesafe dışındaki tüm parametreler belirli bir SICM kurulumunda sabittir, bu nedenle numunenin topografyasını belirlemek için kullanılacak olan, numuneye olan mesafe ile Rt'nin değişimidir.
Genel yaklaşımlar şunlardır: 1) Ag/AgCl elektrotlarının yüzeylerindeki voltaj düşüşü ihmal edilir, uçtaki voltaj düşüşüne kıyasla ihmal edilebilir ve sabit olduğu varsayılır, 2) toplu direncin bir olduğu gerçeği d'nin fonksiyonu, yığındaki uç ile elektrot arasındaki mesafeye bağlı olduğu için ihmal edilir.
Diğer taramalı prob mikroskopi teknikleriyle karşılaştırma
SICM daha kötü bir çözünürlüğe sahiptir AFM veya STM rutin yaklaşık 0.1 nm çözünürlük ulaşabilir. SICM ölçümünün çözünürlüğü teorik olarak uç açıklığının çapının 1,5 katı ile sınırlıdır, ancak 13 nm açıklık çapı ile alınan ölçümler yaklaşık 3-6 nm çözünürlüğü yönetmiştir.
SICM, STM ile imkansız olan zayıf veya iletken olmayan yüzeyleri görüntülemek için kullanılabilir.
SICM ölçümlerinde, mikro pipetin ucu numunenin yüzeyine değmez; yumuşak numunelerin (hücreler, biyolojik numuneler, hücre villusları) deformasyon olmadan görüntülenmesini sağlar.
SICM, elektrolit içeren bir solüsyonda kullanılır, bu nedenle fizyolojik ortamlarda kullanılabilir ve canlı hücre ve dokuları görüntüleyebilir ve biyolojik süreçleri meydana gelirken izleyebilir.
Atlama modunda, dik eğimli ve oluklu profilleri doğru bir şekilde belirleyebilir.
Görüntüleme modları
SICM'de dört ana görüntüleme modu vardır: sabit z modu, Doğru akım (sabit mesafe) modu, alternatif akım modu ve atlama/geri adım/ayakta yaklaşma modu.
Sabit-z modu
Sabit z modunda, mikro pipet, yanal olarak hareket ettirilirken sabit bir z (yükseklik) değerinde tutulur ve direnç izlenir, varyasyonları numunenin topografyasının yeniden oluşturulmasına izin verir. Bu mod hızlıdır ancak yalnızca çok düz numuneler üzerinde çalıştığı için pek kullanılmaz. Numune pürüzlü yüzeylere sahipse, pipet numuneye çarpacak veya numunenin çoğunu görüntülemek için çok uzakta olacaktır.
Doğru akım modu
Doğru akım (DC) modunda (sabit mesafe modu), mikro pipet önceden tanımlanmış bir dirence ulaşılana kadar numuneye doğru indirilir. Pipet daha sonra yanal olarak hareket ettirilir ve bir geri besleme döngüsü numuneye olan mesafeyi korur (direnç değeri aracılığıyla). Pipetin z konumu, numunenin topografyasını belirler. Bu mod numunedeki dik eğimleri algılamaz, bu gibi durumlarda numuneyle temas edebilir ve elektrot kaymasına eğilimlidir.
Alternatif akım modu
Alternatif akım (AC) modunda, mikro pipet normal hareketine ek olarak dikey olarak salınım yapar. Pipet hala yüzeyden uzaktayken iyonik akım ve direnç sabittir, bu nedenle pipet alçalır. Direnç salınmaya başladığında, genlik, önceden tanımlanmış bir genliğe ulaşılana kadar konumu modüle etmek için geri besleme görevi görür.
AC bileşeninin yanıtı DC'den çok daha dik artar ve daha karmaşık örneklerin kaydedilmesine olanak tanır.
atlama modu
Atlamalı (/geri adım/ayakta yaklaşma) modunda, mikro pipet belirli bir dirence ulaşılana kadar numuneye indirilir ve yükseklik kaydedilir. Daha sonra pipet geri çekilir, yana doğru hareket ettirilir ve başka bir ölçüm yapılır ve işlem tekrarlanır. Numunenin topografyası daha sonra yeniden oluşturulabilir.
Atlama modu diğerlerinden daha yavaştır, ancak numune yüzeyini bozmadan karmaşık topografiyi ve hatta tüm hücreleri görüntüleyebilir. · .
Diğer tekniklerle kombinasyonlar ve alternatif kullanımlar
SICM, sıçan beyninden canlı bir nöral hücreyi görüntülemek, mikrovillilerin yaşam döngüsünü belirlemek, spermatozoadaki protein komplekslerinin hareketini gözlemlemek için kullanıldı.
SICM, floresan mikroskobu ve rezonans enerji transferi için birleştirilmiştir.
SICM, pipeti bir hücrenin yüzeyine emme yoluyla sıkıştıran ve ardından hücre zarındaki sodyum kanallarının aktivitesini izleyen bir "akıllı yama-kelepçe" tekniğinde kullanılmıştır.
AFM ve SICM'nin bir kombinasyonu, iyonik çözeltilerde sentetik membranların yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde edebildi.
Taramalı yakın alan optik mikroskopisi SICM ile kullanılmıştır; SICM ölçümü, pipetin ucunun numune yüzeyine çok yakın yerleştirilmesine izin verdi. Mikro pipetin içinden gelen floresan partiküller, sürekli yenilenen SNOM için bir ışık kaynağı sağlar ve fotoağarmayı önler.
FSICM (Hızlı SICM), özellikle atlama modunun hızını artıran son zamanlarda geliştirilmiştir.