Solunum ölçümü - Respirometry

Solunum oranları tahminleri elde edilmesi için bir takım teknikler kapsayan genel bir terimdir metabolizma ve omurgalılar , omurgasızlar , bitkiler , dokular, hücreler veya mikroorganizmalar , ısı üretimi (dolaylı bir tedbir vasıtasıyla kalorimetri ).

Bütün hayvan metabolizma hızları

Bir hayvan metabolizması oranları belirleyerek tahmin edilir karbondioksit üretimi (VCO ₂ ) ve oksijen tüketimi (VO ₂ ya kapalı ya da açık-devre Solunum sisteminde, ayrı ayrı hayvanlar). Tipik olarak iki ölçü elde edilir: standart (SMR) veya bazal metabolik hız (BMR) ve maksimum hız ( VO2max ). SMR özel laboratuar (sıcaklık, hidrasyon) ve özel alan koşulları (örneğin, boyut veya altında hayvan dururken ölçülmüştür (ancak uykuda olan) olduğu allometry ), yaş, üreme durumu önlemek için emici-sonrası gıda termik etkisi ) . VO ₂ maksimum tipik olarak ya da fizyolojik sınırlar yakınındaki aerobik egzersiz sırasında belirlenir. Buna karşılık, saha metabolik hızı (FMR), doğada sınırsız, aktif bir hayvanın metabolik hızını ifade eder. Bütün hayvan metabolik hızları, vücut kütlesi için düzeltme yapılmadan bu ölçümlere atıfta bulunur. SMR veya BMR değerleri, hayvanın vücut kütle değerine bölünürse, hız kitleye özgü olarak adlandırılır. Türler arasındaki karşılaştırmalarda tipik olarak duyulan bu kitleye özgü değerdir.

Kapalı solunum ölçümü

Respirometri, "içeri giren dışarı çıkmalı" ilkesine dayanır. Önce kapalı bir sistem düşünün. Bir fareyi hava geçirmez bir kaba koyduğumuzu hayal edin . Kap içinde kapalı bir hava ilk olarak aynı bileşime ve odada mevcut olan gazların oranlarını içerir: 20.95% O ₂ , % 0.04 CO ₂ , su buharı (tam miktarı sıcaklığına bağlıdır, bakınız erime noktası ),% 78 (yaklaşık olarak) N ₂ , %0.93 argon ve geri kalanını oluşturan çeşitli eser gazlar (bkz. Dünya atmosferi ). Zaman geçtikçe, fare odasında CO üreten ₂ O ve su buharı, ancak özler ₂ metabolik taleplere orantılı olarak havadan. Bu yüzden, uzun bir sisteme hacmini bildiği gibi, O konsantrasyonları arasındaki fark ₂ ve CO ₂ biz sızdırmaz başlangıcında fare ile karşılaştırıldığında bölme (taban çizgisi veya referans koşulları) içine sonra mevcut miktarları fare Daha sonra soluduğu havayı farenin ürettiği/tükettiği CO ₂ /O ₂ miktarları olmalıdır . Azot ve argon inert gazlardır ve bu nedenle fraksiyonel miktarları farenin solunumuyla değişmez. Kapalı bir sistemde ortam sonunda hipoksik hale gelecektir .

Açık solunum ölçümü

Bir açık sistem için tasarım kısıtlamaları, hayvan odasının arınma özelliklerini ve gaz analizörlerinin hassasiyetini içerir. Ancak temel ilke aynı kalır: İçeri giren dışarı çıkmalıdır. Açık ve kapalı bir sistem arasındaki temel fark, açık sistem sürekli olarak O takviyesi bir hızda bölme (yani, hava pompası tarafından itilir veya çekilir) boyunca hava akışı olmasıdır ₂ CO kaldırılırken hayvan tarafından tüketilmiş ₂ ve su hayvan tarafından üretilen buhar. Hacimsel akış oranı , aynı zamanda, hızı o kadar hayvan yeterli O tüketmesini yeterince düşük olması gerekir iken hayvan hiç bölmesi içinde oksijenin tüm tüketir sağlamak için yeterince yüksek olmalıdır ₂ tespiti için. 20 g'lık bir fare için , 500 ml'lik kaplar boyunca yaklaşık 200 ml/dakikalık akış hızları iyi bir denge sağlayacaktır. Bu akış oranı ile, O ila yaklaşık 40 mi ₂ odasına getirilir ve oda içindeki havanın tüm hacmi 5 dakika içinde değiştirilir. Diğer daha küçük hayvanlar için, oda hacimleri çok daha küçük olabilir ve akış hızları da aşağı doğru ayarlanabilir. Söz konusu Not sıcak kanlı veya endotermik hayvanlar ( kuşlar ve memeliler ), bölme boyutları ve veya akış oranları bunların daha yüksek metabolik oranları karşılamak için seçilecektir.

hesaplamalar

VO hesaplanması oranları ₂ ve / veya VCO ₂ içine ve odadan dışarı akış oranlarının bilgi, artı içine ve hayvan gözünden dışarı gaz karışımlarının fraksiyonel konsantrasyonlarını gerektirmektedir. Genel olarak, metabolik hızlar, kararlı durum koşullarından hesaplanır (yani, hayvanın metabolik hızının sabit olduğu varsayılır). Tüketilen oksijen oranlarını bilmek için, hayvan odasına göre akış ölçerin konumunu bilmek gerekir (odadan önce konumlandırılmışsa akış ölçer "yukarı akıştadır", hazneden sonra yerleştirilmişse akış ölçer "aşağı akıştadır". ") ve reaktif gazların mevcut olup olmadığı (örneğin, CO ₂ , su , metan , bkz. soy gaz ).

Yukarı akış ölçer, suyun (örneğin, susuz açık bir sistem için kalsiyum sülfat ) ve CO ₂ (örneğin, bir karbon dioksit adsorban Askarit II, Arthur H. Thomas Co tescilli marka) gibi önce çıkarılır oksijen analizör, bir uygun denklem

{\ce {VO2={\frac {{\mathit {FR}}}\cdot ({\mathit {F}}_{in}O2-{\mathit {F}}_{ex}O2)} {1-{\mathit {F}}_{ex}O2}}}}

Alt akış ölçer, su ve CO ile açık bir sistem için, ₂ işleminden önce çıkartılır oksijen analizörü, uygun bir denklemdir

{\ce {VO2={\frac {{\mathit {FR}}}\cdot ({\mathit {F}}_{in}O2-{\mathit {F}}_{ex}O2)} {1-{\mathit {F}}_{in}O2}}}}

nerede

FR , STP'ye ayarlanmış hacimsel akış hızıdır (bkz . Sıcaklık ve basınç için standart koşullar )
F _de O _2'de mevcut oksijen fraksiyonel miktarı içinde mevcut hava akımı (taban çizgisi veya referans) ve
F _ex O ₂ mevcut oksijen fraksiyonel bir miktarının olan ex (hayvan birim zamanda taban çizgisine göre tüketilen ne) mevcut hava akımı.

Örneğin, 20 g bir fare (BMR değerleri Mus musculus ) olabilir FR = 200 mL / dakika ve O fraksiyonel konsantrasyon okuma ₂ olan bir oksijen analizöründen F _içinde , O ₂ = 0,2095, F _ex O ₂ = 0,2072 . Hesaplanan oksijen tüketimi hızı 0,58 mL/dk veya 35 mL/saattir. Bir varsayarsak entalpisi = O için yanma ₂ 20.1 jul mililitre başına, o zaman 703.5 J / h olarak fare için ısı üretimi (ve bu nedenle metabolizma) hesaplamak olacaktır.

Solunum ölçüm cihazları

Açık akış sistemi için, ekipman ve parça listesi, kapalı bir sistemin bileşenlerine kıyasla uzundur, ancak açık sistemin başlıca avantajı, metabolik hızın sürekli kaydedilmesine izin vermesidir. Açık bir sistemde hipoksi riski de çok daha azdır.

Hava akışı için pompalar

Vakum Pompası : havayı hayvan odası ve solunum ölçer akış sistemi içine ve içinden itmek (yani yukarı akış konumu) veya çekmek (yani akış aşağı konumu) için bir pompa gereklidir.
Alt numune pompası: Analizörlerden hava çekmek için küçük, kararlı, güvenilir bir pompa kullanılır.

Akış ölçer ve akış kontrolörleri

Kabarcık akış ölçerler: Akış hızlarını ölçmenin basit ama son derece doğru bir yolu, bilinen hacimdeki işaretler arasında sabun filmi kabarcıklarının cam tüplere zamanlama hareketini içerir. Cam boru altta (itme sistemleri için) veya üstte (çekme sistemleri için) hava akımına bağlanır. Tüpün tabanına takılan küçük bir kauçuk pipet ampulü, sabun köpüğü için hem bir hazne hem de dağıtım sistemi görevi görür. İşlem basittir. İlk olarak, kabarcıkların ilerlediği yol boyunca cam yüzeyi ıslatın (örneğin, bol miktarda sabun hava akımı tarafından cama doğru itilecek şekilde ampule bastırın) neredeyse sürtünmesiz bir yüzey sağlamak için. İkinci olarak, temiz bir baloncuk oluşacak şekilde ampulü sıkıştırın. Elinizde bir kronometre ile, balonun camdaki işaretler arasında hareket etmesi için gereken süreyi kaydedin. Üstteki işarete kaydedilen hacmi not edin (örneğin, 125 = 125 ml), hacmi işaretler arasında hareket etmek için gereken süreye bölün ve sonuç akış hızıdır (ml/s). Bu aletler çeşitli kaynaklardan satın alınabilir, ancak aynı zamanda uygun boyutta, cam hacimsel pipetlerden de yapılabilirler .
Akrilik akış ölçerler : Bazı durumlarda yüksek akış hızları altında, metabolik odalardan geçen akış hızlarını kontrol etmek için basit akrilik akış ölçerler (0-2,5 litre/dk) kullanabiliriz. Sayaçlar metabolik odaların yukarısında bulunur. Akış ölçerlerin kullanımı basittir ancak solunum ölçüm sisteminde kullanım için günde iki kez kalibre edilmelidir: bir kez kayıt başlamadan önce (ancak hayvan haznenin içine kapatıldıktan sonra!!) ve tekrar kaydın sonunda (hayvandan önce) odadan çıkarılır). Akrilik sayaçlar üzerindeki kalibrasyon işaretleri yalnızca yaklaşık değerler olduğundan kalibrasyon bir bubble debimetre ile yapılmalıdır. Akış hızlarının uygun kalibrasyonu için, akış ölçerden geçen havanın hem barometrik basıncının hem de sıcaklığının (oda sıcaklığına eşit olduğunu varsaydığımız) kaydedilmesi gerektiğini unutmayın.
Kütle akış ölçerler : Oksijen tüketimi veya karbondioksit üretimi oranlarını hesaplamak için gerekli denklemler, haznelere giren ve çıkan akış hızlarının tam olarak bilindiğini varsayar. Sıcaklık ve hava basıncından bağımsız akış oranları sağlama avantajına sahip kütle akış ölçerler kullanıyoruz. Bu nedenle, bu akış hızlarının standart koşullara (Standart Sıcaklık Basıncı) göre düzeltilmesi düşünülebilir. Akışı yalnızca tek bir yerde ölçüp kontrol ediyoruz - hazneden aşağı yönde. Bu nedenle, giriş ve çıkış oranlarının aynı olduğunu varsaymalıyız. Bununla birlikte, solunum ölçüm sisteminin inşası sırasında, akışın bütünlüğünü doğrulamak için tüm bağlantılarda tüm adımlarda akış hızı ölçülmelidir.
İğneli vanalar : Kütle akış ölçerler, akış hızlarının ayarlanmasına izin veren kütle akış kontrolörleri ile satın alınabilir . Ancak bunlar pahalıdır. Respirometri araştırmaları genellikle bir seferde birden fazla hayvanı ölçmeye çalışır, bu da hayvan başına bir odacık gerektirir ve böylece her odacıktan kontrollü akış geçer. Akışı kontrol etmek için alternatif ve daha uygun maliyetli bir yöntem, paslanmaz çelik veya karbon çelik iğne valfler yoluyla olacaktır. İğne valfler artı kütle akış ölçerler, istenen akış hızlarını elde etmek için uygun maliyetli bir yol sağlar. Valflerin maliyeti yaklaşık 20 dolar.

Borular ve odalar

Hortum ve bağlantılar : Solunum ölçüm sisteminin bileşenlerini hayvan odasına ve hayvan odasına bağlamak için çeşitli hortum türleri kullanılabilir. Sistemin özelliklerine bağlı olarak çeşitli esnek boru türleri kullanılabilir. Asetil, Bev-A-Line, Kynar, naylon, Tygon boru ve konektörler, sistemin oksitleyici atmosferlerin düşük olduğu (örneğin, yalnızca arka plan ozon seviyeleri) bölgelerinde kullanılabilir; Ozona karşı inert olduğu için kayda değer miktarda ozon bulunması beklentisi varsa teflon boru tavsiye edilir. Teflon tüpler daha maliyetlidir ve esneklikten yoksundur.
Metabolik odalar: Odalar, kapaklar için kauçuk tıpalı cam kavanozlar olabilir; küçük hayvanlar ve böcekler için şırınga fıçıları; veya pleksiglastan yapılmıştır . İdeal olarak, odalar inert malzemelerden yapılmalıdır; örneğin, akrilik plastik O emebilir ₂ ve çok küçük böcekler ile Respirometrik için kötü bir seçim olabilir. Odaların, oda içinde gazların hızlı bir şekilde karışmasını sağlayacak şekilde inşa edilmesi gerekir. Küçük bir omurgalı için en basit metabolik oda, tıpalı bir cam kavanoz olabilir. Durdurucular iki port ile donatılmıştır: hat bağlantıları için kısa Teflon boru uzantıları sağlanmıştır. Teflon boru uzantıları bölmenin içinden itilir ve Teflon boru uzantısının tabanına küçük bir hortum klipsi takılarak hat bağlantısı tamamlanır. Ek olarak, kavanozun içindeki giriş portuna bir uzantı sağlanmalıdır - bu, hayvanın ekspiratuar gazlarının akıştaki akış tarafından yıkanmamasını sağlar. Hayvanın içi mühürlenir ve kauçuk tıpa Velcro kayışlarla yerinde tutulur . Bir yukarı akış sistemi kullanılıyorsa, herhangi bir metabolik oda sızıntısı, hayvan havasının kaybına ve dolayısıyla hayvanın metabolik hızının hafife alınmasına neden olacaktır. Metabolik odadaki bir hayvanı kapattığınızda, mühüre dikkat edilmelidir. Kapağı kapatmadan önce sızdırmazlığı sağlamak için, tıpayı kavanozun içine sıkıca yerleştirin ve düz olduğundan emin olun. 1-2 kayış (2 daha iyidir) kullanın ve sıkıca çekin. Akrilik (Plexiglas) odalar bazı kullanımlar için inşa edilecektir, ancak uygun oturmayı sağlamak için hassas mühendislik gerekecektir; contalar yardımcı olacaktır ve sıkı oturan kelepçelerin akıllıca kullanılması sızıntıları en aza indirecektir.
Ovma tüpleri: Hayvan odasından önce ve sonra su çıkarılmalıdır. Bir düzenleme, büyük bir akrilik sütun kullanmak Drierite (8 meş (ölçek) daha küçük bir örgü (10-20, diğer bir deyişle Cari Olmayan hava akışı ve çeşitli borular kuru (hayvan odasında önce, itme pompa öncesi) akıntıya nispeten kaba, örneğin,) , nispeten ince) Hayvan odasından sonra suyu çıkarmak için drierit. Bir ovma tüpü hazırlamak için, toz parçacıklarının analizörlere gitmesini önlemek için tüpün her iki ucunda az miktarda pamuk olduğundan emin olun. Az miktarda pamuk kullanın, örneğin yaklaşık 0,005 g, ancak borudaki tozu dışarıda tutacak kadar. Büyük miktarlarda pamuk, nemlendiğinde/nemlendiğinde hava akışını engeller. Drieriti bir huni ile tüpe dökün, taneleri sıkıca paketlemek için tüpü tezgaha vurun (yüzey alanını artırmak için - hava + su gevşek Drierite içinden akar, sık sık yıkayıcı değiştirmeyi gerektirir) ve az miktarda sıvı ile kapatın. pamuk. Karbondioksiti çıkarmak için] hayvan odasından önce ve sonra Ascarite II kullanılır (Ascarite II, Arthur H. Thomas Co.'nun tescilli ticari markasıdır). Ascarite II, kostik olan NaOH içerir (bu nedenle cildinize herhangi bir şey sürmeyin ve sudan uzak tutun). Tüpün ucuna az miktarda pamuk yerleştirerek, yolun üçte birini 10–20 mesh Drierite ile doldurarak, az miktarda pamuk ekleyerek ve ardından tüpün üçte birini Ascarite II ile ekleyerek bir fırçalama tüpü hazırlanır, başka bir pamuk tabakası, ardından daha fazla Drierite ve tüpün ağzını başka bir az miktarda pamukla kapatın. Tahılları paketlemek için her katman eklenirken tüpü tezgaha hafifçe vurun. Not: Drierite tekrar tekrar kullanılabilir (fırında ısıtıldıktan sonra), ancak Drierite tekrar tekrar kurutulduğunda rengini kaybeder; Ascarite II bir kez kullanılır ve tehlikeli atık olarak kabul edilir .

analizörler

Karbon dioksit analiz: CO ₂ analiz tipik olarak CO aslında yararlanmak için kızılötesi bazlı tespit yöntemleri kullanmak ₂ biraz daha uzun dalga boylarına sahip kızıl ışık ve yeniden yayan ışın absorbe edecektir. Entire 0.01, analiz ekranlarda panel metre -% 10 CO ₂ aralık ve CO için bir voltaj çıkışı ile orantılı ₂ konsantrasyonu, aynı zamanda veri kayıt için oluşturulur.
Oksijen analizörü: Respirometriye uygun oksijen analizörleri , galvanik ("ortam sıcaklığı"), paramanyetik , polarografik ( Clark tipi elektrotlar) ve zirkonyum ("yüksek sıcaklık") sensörleri dahil olmak üzere çeşitli oksijen sensörlerini kullanır . Galvanik O ₂ analiz bir kullanımı , yakıt hücresi , bir asidik içeren elektrolitin , bir ağır metal anod ve ince bir gaz geçirgen bir membran. Yana kısmi basıncı O ₂ anot sıfıra yakın, O ₂ tarafından tahrik edilen difüzyon için anot bir oranda orantılı ortam O zar ile ₂ kısmi basıncı. Yakıt hücresi O doğru orantılı bir voltaj üretir ₂ membran kısmi basıncının. Kabin sıcaklığı sabit olduğu ve yakıt hücresi boyunca hava akışının sabit ve aralık dahilinde olması şartıyla, yanıt, destekleyici elektronik, yazılım ve diğer hususlara bağlı olarak %0,01 veya daha iyi olacaktır.

Son olarak, bir bilgisayar veri toplama ve kontrol sistemi, sistemi tamamlamak için tipik bir ek olacaktır. Bir grafik kaydedici yerine, bir bilgisayara bağlı bir analogdan dijitale dönüştürücü yardımıyla oksijen tüketiminin ve/veya karbondioksit üretiminin sürekli kayıtları yapılır . Yazılım, deneycinin ihtiyaçlarına uygun olarak sinyali yakalar, filtreler, dönüştürür ve görüntüler. Çeşitli şirketler ve bireyler solunum ölçüm topluluğuna hizmet vermektedir (örneğin, Sable Systems , Qubit Systems, ayrıca bkz. Warthog Systems).

Mitokondriyal metabolik hızlar

Vücudun içinde oksijen hücrelere, hücrelerde ise organizmanın ihtiyaç duyduğu enerjinin çoğunu üreten süreçte tüketildiği mitokondriye iletilir . Mitokondriyal respirometri, tüm canlı bir hayvanı dahil etmeden mitokondri tarafından oksijen tüketimini ölçer ve mitokondriyal fonksiyonu incelemek için ana araçtır. Bu tür respirometrik çalışmalara üç farklı tipte numune tabi tutulabilir: izole edilmiş mitokondri (hücre kültürlerinden, hayvanlardan veya bitkilerden); geçirgenleştirilmiş hücreler (hücre kültürlerinden); ve geçirgenleştirilmiş lifler veya dokular (hayvanlardan). Son iki durumda, hücresel zar, seçici olarak mitokondriyal zarı bozulmadan bırakan kimyasalların eklenmesiyle geçirgen hale getirilir. Bu nedenle, genellikle hücre zarını geçemeyecek olan kimyasallar, mitokondriyi doğrudan etkileyebilir. Hücre zarının geçirgenleşmesiyle hücre, canlı, tanımlanmış bir organizma olarak varlığını durdurur ve yalnızca mitokondriyi hala işlevsel yapılar olarak bırakır. Bütün hayvan solunum ölçümünün aksine, mitokondriyal solunum ölçümü çözelti içinde gerçekleşir, yani numune bir ortam içinde süspanse edilir. Günümüzde mitokondriyal solunum ölçümü esas olarak kapalı oda yaklaşımı ile yapılmaktadır.

Kapalı oda sistemi

Uygun bir ortamda süspanse edilen numune, hava geçirmez şekilde kapatılmış bir metabolik odaya yerleştirilir. Mitokondri, substratların veya inhibitörlerin sıralı eklenmesiyle tanımlanmış “durumlara” getirilir. Mitokondri oksijen tükettiği için oksijen konsantrasyonu düşer. Oksijen konsantrasyonundaki bu değişiklik, haznedeki bir oksijen sensörü tarafından kaydedilir. Oksijen düşüş hızından (oksijen difüzyonu için düzeltme dikkate alınarak) mitokondrinin solunum hızı hesaplanabilir.

Uygulamalar

Basit Araştırma

Mitokondrinin işleyişi biyoenerjetik alanında incelenir . Farklı türlerden mitokondriler arasındaki fonksiyonel farklılıklar, karşılaştırmalı fizyolojinin bir yönü olarak respirometri ile incelenir .

Uygulamalı araştırma

Mitokondriyal respirometri, mitokondriyal hastalıklarda veya mitokondriye (şüpheli) güçlü bir bağlantısı olan hastalıklarda, örneğin diabetes mellitus tip 2 , obezite ve kanser gibi mitokondriyal işlevselliği incelemek için kullanılır . Diğer uygulama alanları, örneğin spor bilimi ve mitokondriyal fonksiyon ile yaşlanma arasındaki bağlantıdır .

ekipman

Olağan ekipman, sızdırmaz bir metabolik oda, bir oksijen sensörü ve veri kaydı, karıştırma, termostatizasyon için cihazlar ve kimyasalları odaya sokmanın bir yolunu içerir. Yukarıda açıklandığı gibi, bütün hayvan solunum ölçümü için malzeme seçimi çok önemlidir. Plastik malzemeler oksijen depolama kapasiteleri nedeniyle hazne için uygun değildir. Plastik malzemeler kaçınılmaz olduğunda (örneğin o-ringler, karıştırıcı kaplamaları veya tıpalar için) çok düşük oksijen geçirgenliğine sahip polimerler ( örneğin PTFE'nin aksine PVDF gibi ) kullanılabilir. Hazne malzemelerinin içine veya dışına kalan oksijen difüzyonu, enstrümantal oksijen arka plan akışı için ölçülen oksijen akışlarını düzelterek işlenebilir. Bahsedilen bileşenleri içeren aletin tamamına genellikle bir oksigraf denir. Yukarıda bahsedilen tüm hayvan rspirometrisi için ekipman sağlayan şirketler genellikle mitokondriyal solunumla ilgili değildir. Topluluğa, Oroboros Instruments, Hansatech, Respirometer Systems & Applications, YSI Life Sciences veya Strathkelvin Instruments gibi şirketler tarafından çok çeşitli fiyat ve gelişmişlik seviyelerinde hizmet verilmektedir.

Languages

In other projects