Protein dizileme - Protein sequencing
Protein dizileme , bir protein veya peptidin tamamının veya bir kısmının amino asit dizisini belirlemenin pratik işlemidir . Bu, proteinin tanımlanmasına veya translasyon sonrası modifikasyonlarının karakterize edilmesine hizmet edebilir . Tipik olarak, bir proteinin kısmi dizilimi , genlerin kavramsal çevirisinden türetilen protein dizilerinin veri tabanlarına referansla onu tanımlamak için yeterli bilgi (bir veya daha fazla dizi etiketi) sağlar .
Protein dizilemesinin iki ana doğrudan yöntemi, kütle spektrometrisi ve bir protein dizici (sıralayıcı) kullanarak Edman bozunmasıdır . Kütle spektrometrisi yöntemleri şu anda protein dizileme ve tanımlama için en yaygın kullanılan yöntemdir, ancak Edman bozunması, bir proteinin N- sonunu karakterize etmek için değerli bir araç olmaya devam etmektedir .
Amino asit bileşiminin belirlenmesi
Sıralı diziyi bulmaya çalışmadan önce bir proteinin sırasız amino asit bileşiminin bilinmesi çoğu zaman arzu edilir, çünkü bu bilgi dizileme sürecindeki hataların keşfini kolaylaştırmak veya belirsiz sonuçları ayırt etmek için kullanılabilir. Belirli amino asitlerin sıklığı bilgisi , proteinin sindirimi için hangi proteazın kullanılacağını seçmek için de kullanılabilir . Düşük seviyelerde standart olmayan amino asitlerin (örneğin norlösin) proteinlere yanlış dahil edilmesi de belirlenebilir. Amino asit frekansını belirlemek için genellikle amino asit analizi olarak adlandırılan genelleştirilmiş bir yöntem aşağıdaki gibidir:
- Bileşen amino asitlerine bilinen miktarda proteini hidrolize edin.
- Amino asitleri bir şekilde ayırın ve miktarını belirleyin.
Hidroliz
Hidroliz , protein örneğinin 6 M hidroklorik asitte 100–110 ° C'ye 24 saat veya daha uzun süre ısıtılmasıyla yapılır. Birçok hacimli hidrofobik gruba sahip proteinler daha uzun ısıtma süreleri gerektirebilir. Bununla birlikte, bu koşullar o kadar kuvvetlidir ki, bazı amino asitler ( serin , treonin , tirozin , triptofan , glutamin ve sistein ) bozulur. Biochemistry Online, bu sorunu aşmak için farklı zamanlar için ayrı numunelerin ısıtılmasını, elde edilen her bir çözeltinin analiz edilmesini ve sıfır hidroliz süresine geri döndürülmesini önerir. Rastall, triptofan ve tirozini klor ve ön oksitleyici sistein saldırısından korumak için tiol reaktifleri veya fenol gibi bozunmayı önlemek veya azaltmak için çeşitli reaktifler önerir . Ayrıca , amid hidrolizinin derecesini belirlemek için gelişen amonyak miktarının ölçülmesini önermektedir .
Ayırma ve kantitasyon
Amino asitler, iyon değişim kromatografisi ile ayrılabilir ve ardından tespitlerini kolaylaştırmak için türevlendirilebilir. Daha yaygın olarak, amino asitler türetilir ve ardından ters fazlı HPLC ile çözülür .
İyon değiştirme kromatografisinin bir örneği, bir matris olarak sülfonatlı polistireni kullanan, asit solüsyonunda amino asitleri ekleyen ve kolondan pH'ı sürekli artan bir tampon geçiren NTRC tarafından verilmektedir . PH, ilgili izoelektrik noktalarına ulaştığında amino asitler ayrıştırılır . Amino asitler ayrıldıktan sonra, ilgili miktarları renkli bir türev oluşturacak bir reaktif eklenerek belirlenir. Amino asit miktarları 10 nmol'den fazlaysa bunun için ninhidrin kullanılabilir; prolin ile reaksiyona girdiğinde sarı, diğer amino asitlerle reaksiyona girdiğinde ise canlı bir mor verir. Amino asit konsantrasyonu, elde edilen çözeltinin absorbansı ile orantılıdır. Çok küçük miktarlarda ile, 10 pmol kadar, floresan türevleri gibi reaktifler kullanılarak oluşturulabilir orto-ftaldehit (OPA) veya floreskamin .
Ön kolon türevlendirmesi, UV ışığı ile tespit edilen bir türevi üretmek için Edman reaktifini kullanabilir. Floresan türevi oluşturan bir reaktif kullanılarak daha fazla hassasiyet elde edilir. Türetilmiş amino asitler, tipik olarak bir C8 veya C18 silika kolonu ve optimize edilmiş bir elüsyon gradyanı kullanılarak ters fazlı kromatografiye tabi tutulur . Ayrıştırılan amino asitler, bir UV veya floresan detektörü kullanılarak tespit edilir ve numunedeki her bir amino asidi ölçmek için türevlendirilmiş standartlar için olanlarla karşılaştırılan tepe alanları.
N- terminal amino asit analizi
Hangi amino asidin bir peptid zincirinin N- terminalini oluşturduğunun belirlenmesi iki nedenden dolayı yararlıdır: bireysel peptid fragmanlarının dizilerinin bütün bir zincir halinde sıralanmasına yardımcı olmak ve Edman bozunmasının ilk turu genellikle safsızlıklar tarafından kirletilmektedir ve bu nedenle N- terminal amino asidin doğru bir tayinini vermez . N- terminal amino asit analizi için genelleştirilmiş bir yöntem şu şekildedir:
- Peptidi, terminal amino asidi seçici olarak etiketleyecek bir reaktifle reaksiyona sokun.
- Proteini hidrolize edin.
- Amino asidi kromatografi ile belirleyin ve standartlarla karşılaştırın.
Terminal amino asitleri etiketlemek için kullanılabilecek birçok farklı reaktif vardır. Hepsi amin grupları ile reaksiyona girer ve bu nedenle lizin gibi amino asitlerin yan zincirlerindeki amin gruplarına da bağlanırlar - bu nedenle doğru noktanın seçildiğinden emin olmak için kromatogramları yorumlarken dikkatli olmak gerekir. En yaygın reaktiflerden ikisi, Sanger'in reaktifi ( 1-floro-2,4-dinitrobenzen ) ve dansil klorür gibi dansil türevleridir . Fenilizotiyosiyanat , Edman degradasyonu için reaktifi de kullanılabilmektedir. Reaktifler renkli türevler ürettiğinden ve yalnızca kalitatif analiz gerektiğinden, lekeye gerek olmaması dışında amino asit bileşiminin belirlenmesinde olduğu gibi aynı sorular burada da geçerlidir. Dolayısıyla, amino asidin kromatografi sütunundan ayrıştırılması gerekmez, sadece bir standartla karşılaştırılır. Dikkate alınması gereken diğer bir husus, herhangi bir amin grubu etiketleme reaktifi ile reaksiyona gireceğinden, iyon değiştirme kromatografisinin kullanılamayacağı ve bunun yerine ince tabaka kromatografisi veya yüksek basınçlı sıvı kromatografisinin kullanılması gerektiğidir.
C-terminal amino asit analizi
İçin uygun yöntemlerin sayısı , C-terminal amino asit analizi, N-terminali analizi mevcut yöntemlerin sayısı çok daha küçüktür. En yaygın yöntem, bir protein çözeltisine karboksipeptidazlar eklemek , düzenli aralıklarla örnekler almak ve zamana karşı bir amino asit konsantrasyonları grafiğini analiz ederek terminal amino asidi belirlemektir. Bu yöntem, polipeptitler ve proteinle bloke edilmiş N terminalleri durumunda çok faydalı olacaktır. C-terminal dizileme, DNA dizilerinden tahmin edilen proteinlerin birincil yapılarının doğrulanmasına ve bilinen kodon dizilerinden gen ürünlerinin herhangi bir translasyon sonrası işlenmesinin saptanmasına büyük ölçüde yardımcı olacaktır.
Edman bozulması
Edman degradasyon bir proteinin amino asit kompozisyonu keşfedilmesi için sipariş verir, çünkü, protein dizilemesi için çok önemli bir reaksiyondur. Otomatik Edman sıralayıcılar artık yaygın kullanımdadır ve yaklaşık 50 amino asit uzunluğuna kadar peptitleri sıralayabilir. Edman bozunması ile bir proteinin sıralanması için bir reaksiyon şeması aşağıdaki gibidir; bazı adımlar daha sonra detaylandırılır.
- 2-merkaptoetanol gibi bir indirgeyici ajan ile proteindeki disülfür köprülerini kırın . Bağların yeniden oluşmasını önlemek için iyodoasetik asit gibi bir koruyucu grup gerekli olabilir.
- Birden fazla varsa, protein kompleksinin tek tek zincirlerini ayırın ve saflaştırın.
- Her zincirin amino asit bileşimini belirleyin.
- Her zincirin terminal amino asitlerini belirleyin.
- Her zinciri 50 amino asit uzunluğunda parçalara ayırın.
- Parçaları ayırın ve saflaştırın.
- Her parçanın sırasını belirleyin.
- Farklı bir bölünme modeli ile tekrarlayın.
- Genel protein dizisini oluşturun.
Peptit parçalarına sindirim
Yaklaşık 50-70 amino asitten daha uzun peptitler, Edman bozunması ile güvenilir bir şekilde sıralanamaz. Bu nedenle, uzun protein zincirlerinin daha sonra ayrı ayrı sıralanabilen küçük parçalara bölünmesi gerekir. Sindirim, tripsin veya pepsin gibi endopeptidazlarla veya siyanojen bromür gibi kimyasal reaktiflerle yapılır . Farklı enzimler, farklı bölünme modelleri verir ve parçalar arasındaki örtüşme, genel bir sekans oluşturmak için kullanılabilir.
Reaksiyon
Sıralanacak peptit, katı bir yüzeye adsorbe edilir. Yaygın bir substrat , bir katyonik polimer olan polibren ile kaplanmış cam elyaftır . Edman reaktifi, fenilizotiyosiyanat (PITC), adsorbe edilmiş peptide % 12 trimetilaminin hafif bazik bir tampon çözeltisi ile birlikte eklenir . Bu, N-terminal amino asidin amin grubu ile reaksiyona girer.
Terminal amino asit daha sonra susuz asit ilavesiyle seçici olarak ayrılabilir . Türev daha sonra , yıkanabilen ve kromatografi ile tanımlanabilen ikame edilmiş bir feniltiyohidantoin verecek şekilde izomerize edilir ve döngü tekrarlanabilir. Her adımın verimliliği yaklaşık% 98'dir ve bu da yaklaşık 50 amino asidin güvenilir bir şekilde belirlenmesine izin verir.
Protein sıralayıcı
Bir protein sıralayıcısı , Edman bozunmasını otomatik bir şekilde gerçekleştiren bir makinedir. Protein veya peptidin bir numunesi, protein sekansatörünün reaksiyon kabında hareketsizleştirilir ve Edman bozunması gerçekleştirilir. Her döngü, protein veya peptidin N- terminalinden bir amino asidi serbest bırakır ve türevlendirir ve salınan amino asit türevi daha sonra HPLC ile tanımlanır. Sekanslama işlemi, ölçülebilir sekansın tamamı oluşturulana kadar veya önceden belirlenmiş bir döngü sayısı için tüm polipeptit için tekrar tekrar yapılır .
Kütle spektrometresi ile tanımlama
Protein tanımlama, amino asit dizisine dayalı olarak ilgilenilen bir proteine (POI) bir ad atama işlemidir. Tipik olarak, genlerinin DNA dizilerinden çıkarılan protein dizilerinin veri tabanlarına referansla proteini tanımlamak için protein dizisinin sadece bir kısmının deneysel olarak belirlenmesi gerekir. Diğer protein karakterizasyonu, POI'nin gerçek N- ve C-terminallerinin doğrulanmasını, sekans varyantlarının belirlenmesini ve mevcut herhangi bir post-translasyonel modifikasyonun tanımlanmasını içerebilir.
Proteolitik sindirimler
Protein tanımlaması için genel bir şema açıklanmaktadır.
- POI tipik olarak SDS-PAGE veya kromatografi ile izole edilir .
- İzole edilmiş POI, Sistein kalıntılarını stabilize etmek için kimyasal olarak modifiye edilebilir (örneğin, S-amidometilasyon veya S-karboksimetilasyon).
- POI, peptitleri oluşturmak için belirli bir proteaz ile sindirilir. Lizin veya Arginin kalıntılarının C-terminal tarafında seçici olarak bölünen tripsin , en yaygın kullanılan proteazdır. Avantajları arasında i) proteinlerdeki Lys ve Arg kalıntılarının sıklığı, ii) enzimin yüksek özgüllüğü, iii) enzimin stabilitesi ve iv) triptik peptitlerin kütle spektrometrisi için uygunluğu bulunmaktadır.
- Peptidler, iyonlaşabilir kirleticileri uzaklaştırmak için tuzdan arındırılabilir ve MALDI-TOF kütle spektrometrisine tabi tutulabilir . Peptitlerin kütlelerinin doğrudan ölçümü, proteini tanımlamak için yeterli bilgi sağlayabilir (bakınız Peptit kütle parmak izi ), ancak kütle spektrometresi içindeki peptitlerin daha fazla parçalanması, genellikle peptitlerin sekansları hakkında bilgi elde etmek için kullanılır. Alternatif olarak, peptitler tuzdan arındırılabilir ve ters fazlı HPLC ile ayrılabilir ve bir ESI kaynağı yoluyla bir kütle spektrometresine dahil edilebilir . LC-ESI-MS, protein tanımlaması için MALDI-MS'den daha fazla bilgi sağlayabilir ancak daha fazla alet süresi kullanır.
- Kütle spektrometresinin tipine bağlı olarak, peptit iyonlarının parçalanması, Çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) veya Kaynak sonrası bozunma (PSD) gibi çeşitli mekanizmalar yoluyla meydana gelebilir . Her durumda, bir peptidin fragman iyonlarının modeli, sekansı hakkında bilgi sağlar.
- Varsayılan peptit iyonlarının ve bunların fragman iyonlarının ölçülen kütlesini içeren bilgiler daha sonra kavramsal (in-siliko) proteoliz ve protein sekanslarının veri tabanlarının parçalanmasından hesaplanan kütle değerleriyle eşleştirilir. Başarılı bir eşleşme, skoru analiz parametrelerine göre bir eşiği aşarsa bulunur. Gerçek protein veri tabanında gösterilmese bile, hata toleranslı eşleştirme, homolog proteinlere benzerliğe dayalı olarak bir proteinin varsayılan tanımlamasına izin verir . Bu analizi gerçekleştirmek için çeşitli yazılım paketleri mevcuttur.
- Yazılım paketleri genellikle, tanımlanan her bir proteinin kimliğini (erişim kodu), eşleşme puanını gösteren bir rapor oluşturur ve birden çok proteinin tanımlandığı eşlemenin göreli gücünün bir ölçüsünü sağlar.
- Tanımlanan proteinin sekansı üzerindeki eşleşen peptitlerin bir diyagramı, genellikle sekans kapsamını (peptit olarak tespit edilen proteinin% 'si) göstermek için kullanılır. POI'nin eşleşen proteinden önemli ölçüde daha küçük olduğu düşünüldüğünde, diyagram POI'nin tanımlanan proteinin bir N- veya C-terminal parçası olup olmadığını önerebilir.
De novo sıralama
Bir peptidin parçalanma modeli, de novo dizileme yoluyla dizisinin doğrudan belirlenmesine izin verir . Bu sekans, protein sekanslarının veri tabanlarını eşleştirmek veya translasyon sonrası veya kimyasal modifikasyonları araştırmak için kullanılabilir . Yukarıdaki gibi gerçekleştirilen protein tanımlamaları için ek kanıt sağlayabilir.
N- ve C-terminalleri
Protein tanımlaması sırasında eşleştirilen peptitler, eşleşen protein için tahmin edilen N- veya C-uçlarını içermeyebilir. Bu, N- veya C-terminal peptitlerinin MS tarafından tanımlanmasının zor olmasından (örneğin, çok kısa veya çok uzun), translasyon sonrası modifiye edilmesinden (örneğin N-terminal asetilasyon) veya tahminden gerçekten farklı olmasından kaynaklanabilir. Translasyon sonrası değişiklikler veya kesilmiş uçlar, verilerin daha yakından incelenmesi ile tanımlanabilir (yani, de novo sıralama). Farklı özgüllükte bir proteaz kullanan tekrarlı bir sindirim de faydalı olabilir.
Çeviri sonrası değişiklikler
MS verilerinin bilinen protein sekansına dayalı tahminlerle detaylı karşılaştırması, çeviri sonrası modifikasyonları tanımlamak için kullanılabilirken, veri toplamaya yönelik hedefli yaklaşımlar da kullanılabilir. Örneğin, fosfopeptitlerin spesifik zenginleştirilmesi, bir proteindeki fosforilasyon bölgelerinin belirlenmesine yardımcı olabilir . ETD veya ECD gibi kütle spektrometresinde alternatif peptit fragmantasyon yöntemleri, tamamlayıcı sekans bilgisi verebilir.
Tüm kütle tayini
Proteinin tüm kütlesi, amino asit kalıntılarının kütleleri artı bir su molekülünün kütlesinin toplamıdır ve herhangi bir çeviri sonrası değişiklik için ayarlanmıştır. Proteinler, kendilerinden türetilen peptitlerden daha az iyonize olsalar da, çözelti içindeki bir protein ESI-MS'ye tabi tutulabilir ve kütlesi 20.000'de 1 parça veya daha iyi bir doğrulukla ölçülebilir. Bu genellikle, terminalleri doğrulamak (böylece proteinin ölçülen kütlesi, dizisinden tahmin edilenle eşleşir) ve birçok translasyon sonrası modifikasyonun varlığını veya yokluğunu anlamak için yeterlidir.
Sınırlamalar
Proteoliz her zaman POI'nin tüm dizisini kapsayan, kolaylıkla analiz edilebilen bir dizi peptid sağlamaz. Kütle spektrometresindeki peptitlerin parçalanması çoğu zaman her peptit bağında bölünmeye karşılık gelen iyonlar vermez. Bu nedenle, her bir peptit için çıkarsanan sekansın mutlaka tamamlanmış olması gerekmez. Standart parçalanma yöntemleri, izomerik olduklarından lösin ve izolösin kalıntıları arasında ayrım yapmaz.
Edman bozunması proteinin N-terminalinden ilerlediğinden, N-terminali kimyasal olarak modifiye edilmişse (örneğin asetilasyon veya Pyroglutamik asit oluşumu) çalışmayacaktır. Edman bozunması, genellikle disülfür köprülerinin konumlarını belirlemek için yararlı değildir. Aynı zamanda, fark edilebilir sonuçlar için 1 pikomol veya üzeri peptit miktarları gerektirir, bu da onu kütle spektrometresinden daha az hassas hale getirir .
DNA / RNA dizilerinden tahmin etme
Biyolojide proteinler, mesajcı RNA'nın (mRNA) mRNA'daki kodon dizisinden türetilen protein dizisi ile çevrilmesi yoluyla üretilir . MRNA'nın kendisi genlerin transkripsiyonu ile oluşturulur ve ayrıca modifiye edilebilir. Bu süreçler, tam genom DNA dizileme projeleri gibi DNA dizilerinden protein dizilerinin tahminlerini otomatikleştirmek için bilgisayar algoritmalarını kullanmak için yeterince anlaşılmıştır ve UniProt gibi büyük protein dizileri veri tabanlarının oluşturulmasına yol açmıştır . Öngörülen protein dizileri, kütle spektrometresi ile protein tanımlaması için önemli bir kaynaktır.
Tarihsel olarak, Edman bozunması ile belirlenen kısa protein dizileri (10 ila 15 kalıntı) , karşılık gelen genin veya tamamlayıcı DNA'nın moleküler klonlarını izole etmek için problar veya primerler olarak kullanılabilen DNA dizilerine geri çevrildi . Klonlanan DNA'nın dizisi daha sonra belirlendi ve proteinin tam amino asit dizisini çıkarmak için kullanıldı.
Biyoinformatik araçları
Biyoinformatik araçları, kütle spektrumlarının yorumlanmasına (bkz. De novo peptid dizileme ), protein dizilerini karşılaştırmaya veya analiz etmeye (bkz. Dizi analizi ) veya peptit veya protein dizilerini kullanarak veri tabanlarını araştırmaya (bkz. BLAST ) yardımcı olmak için mevcuttur.
Ayrıca bakınız
Referanslar
daha fazla okuma
- Steen H, Mann M (Eylül 2004). "ABC'ler (ve XYZ'ler) peptit sıralaması". Doğa Moleküler Hücre Biyolojisini İnceliyor . 5 (9): 699–711. doi : 10.1038 / nrm1468 . PMID 15340378 .