Fenol-kloroform ekstraksiyonu - Phenol–chloroform extraction

Fenol-kloroform ile ekstraksiyon a, sıvı-sıvı ekstraksiyonu tekniğinde moleküler biyoloji ayırmak için kullanılan nükleik asitler ile ilgili proteinler ve lipidler .

İşlem

Sulu numuneler, parçalanmış hücreler veya homojenleştirilmiş doku, eşit hacimlerde bir fenol : kloroform karışımı ile karıştırılır. Bu karışım daha sonra santrifüjlenir. Çünkü fenol : kloroform , bir üst sulu faz ve bir alt organik faz: Karışım su ile karışmayan, santrifüj iki forma belirgin faz neden olur. Sulu faz, fenol: kloroform içeren organik fazdan daha az yoğun olduğu için en üste çıkar. Yoğunluktaki bu fark, sudan sadece biraz daha yüksek bir yoğunluğa sahip olan fenolün, sudan çok daha yüksek yoğunluklu bir karışım oluşturmak için kloroform ile karıştırılması gerektiğidir.

Hidrofobik lipidler alt organik faza bölünecek ve proteinler iki faz arasındaki ara fazda kalırken, nükleik asitler (tuzlar, şekerler, vb. Gibi diğer kirleticiler) üst sulu fazda kalacaktır. Üst sulu faz daha sonra pipetle alınabilir. Arayüzde herhangi bir organik faz veya materyalin pipetlenmesini önlemek için özen gösterilmelidir . Bu prosedür, DNA'nın saflığını artırmak için genellikle birçok kez gerçekleştirilir. Bu prosedür, PCR veya RFLP'de kullanılabilen büyük çift sarmallı DNA verir .

Karışım asidik ise, RNA sulu fazda kalırken DNA organik fazda çökelecektir . Bunun nedeni, DNA'nın RNA'dan daha kolay nötralize olmasıdır.

Bu tekniğin adli kullanımda bazı dezavantajları vardır. Zaman alıcıdır ve tehlikeli reaktifler kullanır. Ayrıca, reaktiflerin tüpler arasında transferini içeren iki aşamalı bir işlem olduğundan, daha fazla kontaminasyon riski altındadır .

Ayrıca bakınız

Referanslar