falloidin - Phalloidin
|
|
| tanımlayıcılar | |
|---|---|
|
3B model ( JSmol )
|
|
| chebi | |
| Kimyasal Örümcek | |
| ECHA Bilgi Kartı |
100.037.697 
|
|
PubChem Müşteri Kimliği
|
|
| ÜNİİ | |
|
CompTox Panosu ( EPA )
|
|
|
|
|
|
| Özellikler | |
| C 35 H 48 N 8 O 11 S | |
| Molar kütle | 788.87 g·mol -1 |
| Dış görünüş | İğneler |
| Erime noktası | 281 °C (538 °F; 554 K) (sulu) |
|
Aksi belirtilmedikçe, veriler standart durumdaki malzemeler için verilmiştir (25 °C [77 °F], 100 kPa'da). |
|
 doğrulamak ( nedir ?)
  |
|
| Bilgi kutusu referansları | |
Phalloidin , ölüm başlığı mantarında ( Amanita phalloides ) bulunan, phallotoksin adı verilen bir toksin sınıfına aittir . Kan dolaşımına enjekte edildiğinde birkaç gün sonra öldürücü olan sert bir bisiklik heptapeptiddir . Phalloidin zehirlenmesinin ana semptomu, karaciğer hücrelerinin tahrip olması nedeniyle akut açlıktır. Filamentli aktin (F-aktin) bağlayarak ve stabilize ederek işlev görür ve aktin liflerinin depolimerizasyonunu etkili bir şekilde önler. F-aktin'e sıkı ve seçici bağlanması nedeniyle, floresan etiketler içeren phalloidin türevleri, biyomedikal araştırmalarda F-aktin'i görselleştirmek için mikroskopta yaygın olarak kullanılmaktadır.
Keşif ve arka plan
Phalloidin, keşfedilen ilk siklik peptitlerden biriydi. Feodor Lynen ve Ulrich Wieland tarafından 1937'de ölüm başlığı mantarından izole edilmiş ve kristalize edilmiştir . Bisiklik bir heptapeptid oluşturmak için bir sistein - triptofan bağlantısı içermesi bakımından yapısı olağandışıdır . Bu bağlantı daha önce karakterize edilmemişti ve phalloidinin yapı açıklamasını önemli ölçüde zorlaştırıyor. UV spektroskopisi kullanarak kükürt atomunun varlığını belirlediler ve bu halka yapısının hafifçe kaymış bir dalga boyuna sahip olduğunu buldular. Raney nikel deneyleri, triptofan halkasında kükürt varlığını doğruladı. Araştırmacılar, kükürtten arındırılmış phalloidinin hala dairesel olduğunu buldular, bu da phalloidinin yapısının normalde bisiklik olduğunu gösterdi. Lineerleştirildikten sonra, kükürtten arındırılmış phalloidinin amino asit dizisi, 1955'te Wieland ve Schön tarafından Edman degradasyonu yoluyla aydınlatıldı .
Aktin için yüksek afinitesi nedeniyle, bilim adamları, aktin mikroskopisinde etkili görselleştirme için bir boyama reaktifi olarak potansiyel kullanımını keşfettiler. Floroforlarla konjuge edilmiş türevler yaygın olarak satılmaktadır. Aktin monomerlerini (G-aktin) değil, filamentli aktin (F-aktin) seçici olarak bağlama kabiliyeti nedeniyle, flüoresan olarak etiketlenmiş phalloidin, aktine karşı antikorlardan daha etkilidir.
sentez
biyosentez
Phalloidin, olağandışı bir sistein-triptofan bağlantısı içeren bir bisiklik heptapeptiddir. Phalloidin sentezini kodlayan gen, Death Cap mantarındaki MSDIN ailesinin bir parçasıdır ve 34 amino asitlik bir propeptidi kodlar. Bir prolin kalıntısı, daha sonra phalloidin haline gelecek olan yedi kalıntılı bölgeyi çevreler. Translasyondan sonra peptidin proteolitik olarak kesilmesi, siklize edilmesi, hidroksile edilmesi, triptatiyonin oluşturmak için Trp-Cys çapraz bağlanması ve bir D-Thr oluşturmak için epimerize edilmesi gerekir. Bu adımların sırası ve kesin biyokimyasal mekanizması henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Mevcut inanç, gerekli biyosentetik genlerin MSDIN genlerinin yakınında kümelendiği yönündedir.
34-merin ilk translasyon sonrası modifikasyonu, 10-amino asit "lider" peptidi çıkarmak için bir prolil oligopeptidaz (POP) yoluyla proteolitik bölünmedir. POP daha sonra amino asit 1 (Ala) ve amino asit 7 (Pro) arasında transpeptidasyon yoluyla heptapeptid Ala-Trp-Leu-Ala-Thr-Cys-Pro'yu siklize eder. Daha sonra Trp-Cys çapraz bağlama yoluyla triptatiyonin oluşumunun meydana geldiğine inanılmaktadır.
kimyasal sentez
Phalloidin, aktin polimerlerini bağlama ve stabilize etme yeteneğinden yararlanıldığından, ancak hücreler bunu kolayca alamadığından, bilim adamları, araştırmalarda phalloidin türevlerinin daha faydalı olduğunu bulmuşlardır. Esasen, hidroksil-prolin kullanılarak tipik küçük peptit sentezini takip eder. Sentezdeki en büyük zorluk, triptatiyonin bağının (sistein - triptofan çapraz bağı) oluşmasıdır.
Aşağıda, Anderson ve diğerleri tarafından yürütülen genel sentetik mekanizma yer almaktadır. ala 7- phalloidinin katı faz sentezi için 2005'te , kalıntı 7'de phalloidinden aşağıda belirtildiği gibi farklıdır. THPP, sentez sırasında molekülü katı desteğe bağlamak için kullanılan tetrahidropiranil polistiren bağlayıcı anlamına gelir. Aşağıdaki sentezin, başlangıç malzemelerini bağlamak için bağ oluşum sırasını gösteren genel bir şema olduğuna dikkat edin. Ala 7- phalloidin ve ayrıca birçok benzer phalloidin varyantı, phalloidine göre hücre alımını arttırmak ve F-aktin'in mikroskopta görüntülenmesine yardımcı olmak için bir florofor eklemek için faydalıdır.
Phalloidinin ilk toplam sentezi, katı faz ve çözelti fazı sentezinin bir kombinasyonu yoluyla elde edildi (Baosheng Liu ve Jianheng Zhang, Birleşik Devletler Patenti, US 8,569,452 B2). Sentetik phalloidinin fiziksel ve kimyasal özellikleri, doğal olarak oluşan phalloidin ile aynıdır.
Hareket mekanizması
Phalloidın bağlandığı F aktin , onun önlenmesi depolimerizasyonunu ve hücre zehirlenmesi. Phalloidin, özellikle F-aktin alt birimleri arasındaki arayüze bağlanır ve bitişik alt birimleri birbirine kilitler. Bir bisiklik heptapeptid olan phalloidin, aktin filamentlerine aktin monomerlerinden çok daha sıkı bağlanır ve aktin alt birimlerinin filament uçlarından ayrılması için hız sabitinde bir azalmaya yol açar, bu da filament depolimerizasyonunun önlenmesi yoluyla esas olarak aktin filamentlerini stabilize eder. Ayrıca, phalloidinin F-aktinin ATP hidroliz aktivitesini inhibe ettiği bulunmuştur. Böylece, falloidin, aktin monomerlerini G-aktin'den farklı bir konformasyonda yakalar ve ADP'nin yakalanmasıyla bağlantılı bir olay olan monomer ayrışması için hız sabitini büyük ölçüde azaltarak F-aktinin yapısını stabilize eder. Genel olarak, falloidinin aktin ile stoikiometrik olarak reaksiyona girdiği, aktin polimerizasyonunu kuvvetle desteklediği ve aktin polimerlerini stabilize ettiği bulunmuştur.
Phalloidin, hücrelerde çeşitli konsantrasyonlarda farklı işlev görür. Düşük konsantrasyonlarda sitoplazmaya dahil edildiğinde, phalloidin, daha az polimerize sitoplazmik aktin formlarını ve ayrıca filamini, kümelenmiş aktin polimerlerinin kararlı "adalarına" alır, ancak stres liflerine, yani kalın mikrofilament demetlerine müdahale etmez. Wehland et al. ayrıca, daha yüksek konsantrasyonlarda, phalloidinin hücresel kasılmayı indüklediğini not eder.
Belirtiler
Kısa bir süre sonra ortaya çıkardıkları, bilim adamları farelere Phalloidin enjekte ve keşfedilen LD 50 ile 2 mg / kg'dır İP enjeksiyonu . Minimum öldürücü doza maruz kaldıklarında, bu farelerin ölmesi birkaç gün sürdü. Phalloidin zehirlenmesinin görünen tek yan etkisi aşırı açlıktır. Bunun nedeni, phalloidinin sadece karaciğer tarafından safra tuzu membran taşıma proteinleri yoluyla alınmasıdır. Karaciğere girdikten sonra, phalloidin F-aktin'i bağlayarak depolimerizasyonunu önler. Bu işlemin karaciğer hücrelerini yok etmesi zaman alır. Böbrekler de phalloidin alabilir, ancak karaciğer kadar etkili değildir. Burada phalloidin nefroza neden olur.
Bir görüntüleme aracı olarak kullanın
Phalloidinin özellikleri, phalloidini flüoresan analogları ile etiketleyerek ve bunları ışık mikroskobu için aktin filamentlerini boyamak için kullanarak hücrelerde F-aktin dağılımını araştırmak için yararlı bir araç yapar . Phalloidinin floresan türevlerinin, canlı veya sabit hücrelerde aktin filamentlerinin lokalize edilmesinde ve ayrıca tek tek aktin filamentlerinin in vitro görselleştirilmesinde son derece yararlı olduğu ortaya çıkmıştır . Yüksek çözünürlüklü tekniği florofor için birleşmiş falloidin kullanılarak ışık ve elektron mikroskobi düzeylerinde F-aktin tespit etmek için geliştirilen eosin floresan etiket olarak hareket eder. Floresan foto-oksidasyon olarak bilinen bu yöntemde, diaminobenzidinin (DAB) oksidasyonunu yönlendirmek için floresan moleküller kullanılabilir ve elektron yoğun hale getirilebilen ve elektron mikroskobu ile saptanabilen bir reaksiyon ürünü meydana getirilebilir. Görüntülenen floresan miktarı, doygun miktarlarda floresan phalloidin kullanılıyorsa, hücrelerde bulunan filamentli aktin miktarının nicel bir ölçüsü olarak kullanılabilir. Sonuç olarak, phalloidinin mikro enjeksiyonu ile birlikte immünofloresan mikroskopi, sitoplazmik aktin polimer oluşumunun farklı aşamalarında doğrudan ve dolaylı işlevlerini değerlendirmek için kullanılabilir. Bu nedenle, floresan phalloidin, yüksek çözünürlükte aktin ağlarının çalışmasında önemli bir araç olarak kullanılabilir.
Kullanımlar ve sınırlamalar
Phalloidin, floresan mikroskopi için hücresel proteinleri etiketlemek için tipik olarak kullanılacak olan bir antikordan çok daha küçüktür ve bu, filamentli aktin'in çok daha yoğun bir şekilde etiketlenmesine olanak tanır ve özellikle daha yüksek çözünürlüklerde çok daha ayrıntılı görüntüler elde edilebilir.
Değiştirilmemiş phalloidinler hücre zarlarına nüfuz etmez, bu da onları canlı hücrelerle yapılan deneylerde daha az etkili hale getirir. Büyük ölçüde artan hücre geçirgenliğine sahip phalloidin türevleri sentezlenmiştir.
Falloidinlerle tedavi edilen hücreler bir dizi toksik etki sergiler ve sıklıkla ölürler. Ayrıca, phalloidin ile tedavi edilen hücrelerin, plazma zarlarıyla ilişkili daha yüksek aktin seviyelerine sahip olacağını ve phalloidinin canlı hücrelere mikro enjeksiyonunun, hücre hareketliliğinin yanı sıra aktin dağılımını da değiştireceğini belirtmek önemlidir.