Optik mikroskop - Optical microscope

Floresan mikroskobu için cıva ampullü modern bir optik mikroskop . Mikroskop, bilgisayara bağlı bir dijital kameraya sahiptir .

Optik mikroskop olarak ta anılan ışık mikroskobu , bir tür mikroskop yaygın kullanan görünür ışık ve bir sistem lenslerin küçük nesnelerin büyütülmüş görüntüler oluşturmak için. Optik mikroskoplar, mikroskobun en eski tasarımıdır ve muhtemelen 17. yüzyılda mevcut bileşik formlarında icat edilmiştir. Birçok karmaşık tasarım çözünürlüğü ve numune kontrastını iyileştirmeyi amaçlasa da, temel optik mikroskoplar çok basit olabilir .

Nesne bir sahneye yerleştirilir ve mikroskopta bir veya iki göz merceğinden doğrudan görüntülenebilir . Yüksek güçlü mikroskoplarda, her iki göz merceği de tipik olarak aynı görüntüyü gösterir, ancak stereo mikroskopta 3 boyutlu bir efekt oluşturmak için biraz farklı görüntüler kullanılır. Görüntüyü yakalamak için tipik olarak bir kamera kullanılır ( mikrograf ).

Numune çeşitli şekillerde aydınlatılabilir. Saydam nesneler alttan aydınlatılabilir ve katı nesneler , objektif merceğinden ( parlak alan ) veya çevresinden ( karanlık alan ) gelen ışıkla aydınlatılabilir . Metalik nesnelerin kristal yönelimini belirlemek için polarize ışık kullanılabilir. Faz kontrastlı görüntüleme , farklı kırılma indeksinin küçük ayrıntılarını vurgulayarak görüntü kontrastını artırmak için kullanılabilir.

Farklı büyütme oranlarına sahip bir dizi objektif lens genellikle bir tarete monte edilmiş olarak sağlanır, bu da onların yerlerine döndürülmelerine ve yakınlaştırma yeteneği sağlamalarına olanak tanır. Optik mikroskopların maksimum büyütme gücü, görünür ışığın sınırlı çözme gücü nedeniyle tipik olarak yaklaşık 1000x ile sınırlıdır. Bileşik optik mikroskobun büyütmesi, göz merceğinin (diyelim 10x) ve objektif merceğin (diyelim ki 100x) büyütülmesinin ürünüdür ve toplam 1.000x büyütme elde edilir. Yağ veya ultraviyole ışık kullanımı gibi değiştirilmiş ortamlar büyütmeyi artırabilir.

Görünür ışık kullanmayan optik mikroskopi alternatifleri arasında taramalı elektron mikroskobu ve transmisyon elektron mikroskobu ve taramalı prob mikroskobu bulunur ve sonuç olarak çok daha büyük büyütmeler elde edebilir.

Türler

Basit bir mikroskop diyagramı

İki temel optik mikroskop türü vardır: basit mikroskoplar ve bileşik mikroskoplar. Basit bir mikroskop, büyütme için tek lensin veya lens grubunun optik gücünü kullanır . Bir bileşik mikroskop, bir nesnenin çok daha yüksek büyütmesini elde etmek için bir mercek sistemi (bir başkası tarafından üretilen görüntüyü büyüten bir set) kullanır. Modern araştırma mikroskoplarının büyük çoğunluğu bileşik mikroskoplardır, bazı ucuz ticari dijital mikroskoplar ise basit tek lensli mikroskoplardır. Bileşik mikroskoplar ayrıca optik konfigürasyonları, maliyetleri ve amaçlanan amaçları bakımından farklılık gösteren çeşitli diğer mikroskop tiplerine ayrılabilir.

Basit mikroskop

Basit bir mikroskop, bir nesneyi yalnızca açısal büyütme yoluyla büyütmek için bir mercek veya mercek seti kullanır ve izleyiciye dik büyütülmüş bir sanal görüntü verir . Tek bir dışbükey lens veya lens grubunun kullanımı, örneğin, basit bir büyütme cihazlarda bulunan büyüteç , loupes ve okülerler teleskop ve mikroskopları.

bileşik mikroskop

Bileşik mikroskop diyagramı

Bileşik bir mikroskop , mikroskop içindeki nesnenin gerçek bir görüntüsünü odaklayan ışığı toplamak için ( objektif lens olarak adlandırılır) görüntülenen nesneye yakın bir lens kullanır (görüntü 1). Bu görüntü daha sonra , izleyiciye nesnenin büyütülmüş, ters çevrilmiş sanal görüntüsünü veren ikinci bir mercek veya mercek grubu ( göz merceği olarak adlandırılır ) tarafından büyütülür (resim 2). Bileşik bir objektif/mercek kombinasyonunun kullanılması çok daha yüksek büyütme sağlar. Yaygın bileşik mikroskoplar genellikle değiştirilebilir objektif lenslere sahiptir ve kullanıcının büyütmeyi hızlı bir şekilde ayarlamasını sağlar. Bileşik bir mikroskop, faz kontrastı gibi daha gelişmiş aydınlatma kurulumlarına da olanak tanır .

Diğer mikroskop çeşitleri

Özel amaçlar için bileşik optik mikroskop tasarımının birçok çeşidi vardır. Bunlardan bazıları, belirli amaçlar için uzmanlaşmaya izin veren fiziksel tasarım farklılıklarıdır:

  • Stereo mikroskop , örneğin stereoskopik görüntüsünü sağlayan düşük güçlü bir mikroskop olup, diseksiyon için yaygın olarak kullanılır.
  • İki ayrı ışık yoluna sahip olan karşılaştırma mikroskobu , her bir gözde tek bir görüntü aracılığıyla iki örneğin doğrudan karşılaştırılmasına olanak tanır.
  • Alttan örnekleri incelemek için ters mikroskop ; sıvı içindeki hücre kültürleri veya metalografi için yararlıdır.
  • Konnektör uç yüzü incelemesi için tasarlanmış fiber optik konektör inceleme mikroskobu
  • Yüksek optik çözünürlüklü örnekleri incelemek için seyahat eden mikroskop .

Diğer mikroskop çeşitleri, farklı aydınlatma teknikleri için tasarlanmıştır:

  • Tasarımı genellikle bir polarize filtre, dönen sahne ve optik özellikleri yönelime göre değişebilen minerallerin veya diğer kristal malzemelerin incelenmesini kolaylaştırmak için alçı levha içeren petrografik mikroskop .
  • Polarize mikroskop , petrografik mikroskoba benzer.
  • Faz kontrast aydınlatma yöntemini uygulayan faz kontrast mikroskobu .
  • Florofor içeren numunelerin analizi için tasarlanmış epifloresan mikroskobu .
  • Konfokal mikroskop , floresan için bir numuneyi aydınlatmak için bir tarama lazeri kullanan, yaygın olarak kullanılan bir epifloresan aydınlatma çeşididir.
  • İki fotonlu mikroskop , özellikle canlı örneklerde saçılma ortamında floresansı daha derinde görüntülemek ve fotoağarmayı azaltmak için kullanılır.
  • Öğrenci mikroskobu - genellikle basitleştirilmiş kontrollere sahip düşük güçlü bir mikroskop ve bazen okul kullanımı için veya çocuklar için bir başlangıç ​​enstrümanı olarak tasarlanmış düşük kaliteli optikler.
  • Ultramikroskop , çapı görünür ışığın dalga boyunun altında veya yakınında olan (yaklaşık 500 nanometre) küçük parçacıkların görüntülenmesini sağlamak için ışık saçılımını kullanan uyarlanmış bir ışık mikroskobu ; elektron mikroskoplarının ortaya çıkışından bu yana çoğunlukla modası geçmiş
  • Uçla güçlendirilmiş Raman mikroskobu , geleneksel dalga boyu tabanlı çözünürlük limitleri olmaksızın , uçla güçlendirilmiş Raman spektroskopisine dayanan bir optik mikroskop çeşididir . Bu mikroskop öncelikle tüm optik araçları kullanan taramalı sondalı mikroskop platformlarında gerçekleştirilmiştir .

Dijital mikroskop

Minyatür bir USB mikroskop .

Bir dijital mikroskop , bir ile donatılmış bir mikroskop dijital kamera , bir bir numune gözlenmesini sağlayan bilgisayar . Mikroskoplar ayrıca çeşitli otomasyon seviyeleri ile kısmen veya tamamen bilgisayar kontrollü olabilir. Dijital mikroskopi, örneğin mesafelerin ve alanların ölçümleri ve bir floresan veya histolojik lekenin nicelleştirilmesi gibi bir mikroskop görüntüsünün daha iyi analizini sağlar .

Düşük güçlü dijital mikroskoplar, USB mikroskoplar da ticari olarak mevcuttur. Bunlar esasen yüksek güçlü bir makro lense sahip web kameralarıdır ve genellikle transillüminasyon kullanmazlar . Görüntülerin doğrudan monitörde gösterilmesi için kamera doğrudan bir bilgisayarın USB bağlantı noktasına takılır . Oküler kullanmaya gerek kalmadan ve çok düşük maliyetle mütevazı büyütmeler (yaklaşık 200×'e kadar) sunarlar. Yüksek güçlü aydınlatma genellikle bir LED kaynağı veya kamera merceğine bitişik kaynaklar tarafından sağlanır .

Hassas biyolojik örneklere zarar vermemek için çok düşük ışık seviyelerine sahip dijital mikroskopi, hassas foton sayan dijital kameralar kullanılarak mevcuttur . Dolanık foton çiftleri sağlayan bir ışık kaynağının , ışığa en duyarlı numunelerin zarar görme riskini en aza indirebileceği gösterilmiştir. Foton-seyrek mikroskopi için hayalet görüntülemenin bu uygulamasında , numune, bir foton sayma kamerası tarafından verimli görüntüleme için görünür banttaki dolaşmış bir ortakla uzamsal olarak bağıntılı olan kızılötesi fotonlarla aydınlatılır.

Tarih

Buluş

En eski mikroskoplar, en azından 13. yüzyılda gözlüklerde lenslerin yaygın kullanımı kadar eskiye dayanan sınırlı büyütmeye sahip tek lensli büyüteçlerdi .

Bileşik mikroskoplar ilk olarak 1620'de Avrupa'da ortaya çıktı, bunlardan biri Cornelis Drebbel tarafından Londra'da (1621 civarında) gösterildi ve biri 1624'te Roma'da sergilendi.

Bileşik mikroskobun gerçek mucidi bilinmemektedir, ancak yıllar boyunca birçok iddiada bulunulmuştur. Bunlar, Hollandalı gözlük yapımcısı Johannes Zachariassen tarafından ortaya çıktıktan 35 yıl sonra , babası Zacharias Janssen'in bileşik mikroskobu ve/veya teleskobu 1590 gibi erken bir tarihte icat ettiğine dair bir iddiayı içermektedir. O zamanlar Zacharias'ın bir çocuk olması, Johannes'in iddiasının doğru olması için bileşik mikroskobun Johannes'in büyükbabası Hans Martens tarafından icat edilmiş olması gerektiği yönündeki spekülasyonlara yol açtı. Başka bir iddia, Janssen'in rakibi Hans Lippershey'in (1608'de ilk teleskop patenti için başvuran) da bileşik mikroskobu icat ettiğidir . Diğer tarihçiler, 1621 bileşik mikroskobu ile Hollandalı yenilikçi Cornelis Drebbel'e işaret ediyor.

Galileo Galilei , bazen bir bileşik mikroskop mucidi olarak da anılır . 1610'dan sonra, sinekler gibi küçük nesneleri görmek için teleskobunu yakın odaklayabildiğini ve/veya küçük nesneleri büyütmek için yanlış uçtan tersten bakabileceğini keşfetti. Tek dezavantajı, 2 fit uzunluğundaki teleskopunun, yakındaki nesneleri görebilmek için 6 fit'e kadar uzatılması gerekmesiydi. Galileo, 1624'te Roma'da sergilenen Drebbel'in yaptığı bileşik mikroskobu gördükten sonra kendi geliştirilmiş versiyonunu yaptı. 1625'te Giovanni Faber , Galileo'nun 1624'te Accademia dei Lincei'ye sunduğu bileşik mikroskop için mikroskop adını verdi (Galileo buna " occhiolino " veya " küçük göz " demişti ). Faber gelen ad vermiş Yunan kelimelerinden μικρόν "küçük" ve anlamı (mikron) σκοπεῖν "bakmak" anlamına (skopein), "ile benzer olması gerekiyordu bir isim teleskop ", Linceans tarafından icat başka bir kelime.

Başka bir Hollandalı olan Christiaan Huygens , 17. yüzyılın sonlarında akromatik olarak düzeltilen basit bir 2 lensli oküler sistem geliştirdi ve bu nedenle mikroskop gelişiminde büyük bir adım attı. Huygens oküler bu güne kadar üretilmekte, ancak küçük bir alan boyutu ve diğer küçük dezavantajlardan muzdariptir.

popülerleştirme

Mikroskopla yapıldığı bilinen en eski yayınlanmış görüntü: Arılar, Francesco Stelluti , 1630

Antonie van Leeuwenhoek (1632-1724), 16. yüzyılda basit büyüteç lensler üretiliyor olmasına rağmen, mikroskobu biyologların dikkatine sunmakla tanınır. Van Leeuwenhoek'in ev yapımı mikroskopları, çok küçük ama güçlü bir lensi olan basit mikroskoplardı. Kullanımları garipti, ancak van Leeuwenhoek'in ayrıntılı görüntüleri görmesini sağladı. Bileşik mikroskobun, birden fazla lensi yapılandırmadaki zorluklar nedeniyle van Leeuwenhoek'in basit mikroskoplarıyla aynı kalitede görüntü sağlayabilmesi yaklaşık 150 yıl sürdü. 1850'lerde, Tulane Üniversitesi Kimya Profesörü John Leonard Riddell , kolera ile ilgili en erken ve en kapsamlı Amerikan mikroskobik araştırmalarından birini gerçekleştirirken ilk pratik binoküler mikroskobu icat etti .

Aydınlatma teknikleri

Temel mikroskop teknolojisi ve optikler 400 yılı aşkın bir süredir mevcut olmakla birlikte, günümüzde görülen yüksek kaliteli görüntüleri oluşturmak için örnek aydınlatma tekniklerinin geliştirilmesi çok daha yakın bir zamanda olmuştur.

Ağustos 1893'te August Köhler , Köhler aydınlatmasını geliştirdi . Bu örnek aydınlatma yöntemi, son derece eşit aydınlatma sağlar ve eski örnek aydınlatma tekniklerinin birçok sınırlamasının üstesinden gelir. Köhler aydınlatmasının geliştirilmesinden önce, örneğin bir ampul filamanı gibi ışık kaynağının görüntüsü, numunenin görüntüsünde her zaman görünürdü.

Nobel fizik Hollandalı fizikçi verildi Frits Zernike onun gelişimi için 1953 yılında faz kontrast şeffaf numunelerin görüntülenmesine olanak veren aydınlatma. Işığın absorpsiyonu yerine girişim kullanılarak , canlı memeli hücreleri gibi son derece şeffaf numuneler, boyama tekniklerini kullanmak zorunda kalmadan görüntülenebilir. Sadece iki yıl sonra, 1955'te Georges Nomarski , başka bir girişim tabanlı görüntüleme tekniği olan diferansiyel girişim kontrast mikroskobu teorisini yayınladı .

Floresan mikroskobu

Modern biyolojik mikroskopi, bir hücre içindeki belirli yapılar için floresan probların geliştirilmesine büyük ölçüde bağlıdır . Normal trans- illuminated ışık mikroskobunun aksine, floresan mikroskopide numune, dar bir ışık dalga boyu seti ile objektif lens aracılığıyla aydınlatılır. Bu ışık, numunedeki floroforlarla etkileşir ve daha sonra daha uzun bir dalga boyunda ışık yayar . Görüntüyü oluşturan bu yayılan ışıktır.

20. yüzyılın ortalarından beri, DNA'ya bağlanan DAPI gibi kimyasal floresan boyalar, hücre içindeki belirli yapıları etiketlemek için kullanılmıştır. Daha yeni gelişmeler, bir numune içindeki spesifik proteinleri tanımak için floresan olarak etiketlenmiş antikorları kullanan immünofloresan ve canlı bir hücrenin onu floresan hale getirerek eksprese edebileceği GFP gibi floresan proteinleri içerir .

Bileşenler

Temel optik transmisyon mikroskobu elemanları (1990'lar)

Örnekleri iletilen ışıkla görüntülemek için tasarlanmış tüm modern optik mikroskoplar, ışık yolunun aynı temel bileşenlerini paylaşır. Ek olarak, mikroskopların büyük çoğunluğu aynı 'yapısal' bileşenlere sahiptir (sağdaki resme göre aşağıda numaralandırılmıştır):

  • Mercek (oküler lens) (1)
  • Objektif taret, tabanca veya döner burun parçası (birden fazla objektif lensi tutmak için) (2)
  • Objektif lensler (3)
  • Odak düğmeleri (sahneyi hareket ettirmek için)
    • Kaba ayar (4)
    • İnce ayar (5)
  • Aşama (numuneyi tutmak için) (6)
  • Işık kaynağı (bir ışık veya ayna ) (7)
  • Diyafram ve kondansatör (8)
  • Mekanik aşama (9)

Mercek (oküler lens)

Mercek veya oküler mercek, iki veya daha fazla lens içeren bir silindir olduğu; işlevi, görüntüyü göze odaklamaktır. Mercek, gövde tüpünün üst ucuna yerleştirilir. Göz mercekleri değiştirilebilir ve farklı büyütme dereceleriyle birçok farklı mercek yerleştirilebilir. Okülerler için tipik büyütme değerleri 5×, 10× (en yaygın), 15× ve 20× içerir. Bazı yüksek performanslı mikroskoplarda, objektif lensin ve göz merceğinin optik konfigürasyonu, mümkün olan en iyi optik performansı verecek şekilde eşleştirilir. Bu, en yaygın olarak apokromatik hedeflerle ortaya çıkar .

Objektif taret (tabanca veya döner burun parçası)

Objektif taret, revolver veya döner burun parçası, objektif lens setini tutan kısımdır. Kullanıcının objektif lensler arasında geçiş yapmasını sağlar.

Objektif lens

Tipik bir bileşik optik mikroskobun alt ucunda , numuneden ışık toplayan bir veya daha fazla objektif lens bulunur . Amaç genellikle bir cam tek veya çok elemanlı bileşik lens içeren bir silindir mahfazasındadır. Tipik olarak, gerekli objektif merceği seçmek için döndürülebilen dairesel bir burun parçasına vidalanmış yaklaşık üç objektif merceği olacaktır. Bu düzenlemeler parfokal olacak şekilde tasarlanmıştır , yani bir mikroskopta bir mercekten diğerine geçtiğinde numune odakta kalır . Mikroskop hedefleri, büyütme ve sayısal açıklık olmak üzere iki parametre ile karakterize edilir . İlki tipik olarak 5× ila 100× arasında değişirken, ikincisi sırasıyla yaklaşık 40 ila 2 mm odak uzunluklarına karşılık gelen 0,14 ila 0,7 arasındadır . Daha yüksek büyütme oranına sahip objektif lensler, normalde daha yüksek sayısal açıklığa ve elde edilen görüntüde daha kısa bir alan derinliğine sahiptir . Bazı yüksek performanslı objektif lensler, en iyi optik performansı sağlamak için uyumlu göz mercekleri gerektirebilir.

Yağa daldırma hedefi

İki Leica yağlı daldırma mikroskobu objektif lensi: 100× (sol) ve 40× (sağ)

Bazı mikroskoplar , yüksek büyütmede daha fazla çözünürlük için yağa daldırma hedefleri veya suya daldırma hedefleri kullanır. Bunlar, daldırma yağı veya su gibi indeks uyumlu malzeme ve objektif lens ile numune arasında uyumlu bir lamel ile kullanılır. İndeks uyumlu malzemenin kırılma indisi havadan daha yüksektir ve objektif merceğin daha büyük bir sayısal açıklığa (1'den büyük) sahip olmasına izin verir, böylece ışık numuneden objektif merceğin dış yüzüne minimum kırılma ile iletilir. 1,6 kadar yüksek sayısal açıklıklar elde edilebilir. Daha büyük sayısal açıklık, daha küçük ayrıntıların ayrıntılı gözlemini mümkün kılan daha fazla ışığın toplanmasına izin verir. Bir yağa daldırma merceği genellikle 40 ila 100 × büyütmeye sahiptir.

Odak düğmeleri

Ayar düğmeleri, kaba ve ince odaklama için ayrı ayarlarla sahneyi yukarı ve aşağı hareket ettirir. Aynı kontroller, mikroskobun farklı kalınlıktaki numunelere ayarlanmasını sağlar. Daha eski mikroskop tasarımlarında, odak ayarlama tekerlekleri, mikroskop tüpünü standa göre yukarı veya aşağı hareket ettirir ve sabit bir aşamaya sahiptir.

Çerçeve

Optik düzeneğin tamamı, geleneksel olarak, gerekli sertliği sağlamak için sağlam bir U-şekilli ayağa bağlı olan sert bir kola bağlanır. Kol açısı, görüş açısının ayarlanmasına izin verecek şekilde ayarlanabilir.

Çerçeve, çeşitli mikroskop kontrolleri için bir montaj noktası sağlar. Normalde bu, odaklama kontrollerini, tipik olarak kaba odaklamayı ayarlamak için büyük bir tırtıklı çarkı ve ince odaklamayı kontrol etmek için daha küçük bir tırtıllı çarkı içerecektir. Diğer özellikler, lamba kontrolleri ve/veya kondansatörün ayarlanması için kontroller olabilir.

Sahne

Sahne, görüntülenen numuneyi destekleyen objektif lensin altındaki bir platformdur. Sahnenin ortasında, numuneyi aydınlatmak için ışığın geçtiği bir delik bulunur. Sahne genellikle slaytları tutmak için kollara sahiptir (örneğin üzerine numunenin monte edildiği tipik 25×75 mm boyutlarında dikdörtgen cam plakalar).

100×'den daha yüksek büyütmelerde, slaytı elle hareket ettirmek pratik değildir. Orta ve daha yüksek fiyatlı mikroskopların tipik bir özelliği olan mekanik bir aşama, numuneyi/slaydı istendiği gibi yeniden konumlandıran kontrol düğmeleri aracılığıyla slaytın küçük hareketlerine izin verir. Bir mikroskobun orijinal olarak mekanik bir aşaması yoksa, bir tane eklemek mümkün olabilir.

Odaklanmak için tüm aşamalar yukarı ve aşağı hareket eder. Numune detaylarını incelemek için numuneyi konumlandırmak için mekanik bir kademeli kızaklar iki yatay eksende hareket eder.

Numuneyi sahnede kullanıcı tarafından ortalamak için odaklama daha düşük büyütmede başlar. Daha yüksek bir büyütmeye geçmek, daha yüksek büyütmede yeniden odaklanmak için sahnenin dikey olarak daha yükseğe taşınmasını gerektirir ve ayrıca hafif yatay numune konumu ayarlaması gerektirebilir. Yatay numune konumu ayarlamaları, mekanik bir aşamaya sahip olmanın nedenidir.

Numuneleri hazırlamanın ve slaytlara monte etmenin zorluğu nedeniyle, çocuklar için, kullanılan odak seviyesinden bağımsız olarak ortalanmış ve kolayca odaklanan hazırlanmış slaytlarla başlamak en iyisidir.

Işık kaynağı

Birçok ışık kaynağı kullanılabilir. En basit haliyle, gün ışığı bir ayna aracılığıyla yönlendirilir . Bununla birlikte, çoğu mikroskop, kendi ayarlanabilir ve kontrol edilebilir ışık kaynağına sahiptir - genellikle bir halojen lamba , ancak LED'ler ve lazerler kullanılarak yapılan aydınlatma daha yaygın bir hüküm haline geliyor. Köhler aydınlatması genellikle daha pahalı cihazlarda sağlanır.

yoğunlaştırıcı

Kondansatör numunenin üzerine aydınlatma kaynağından gelen ışık odaklanmak için tasarlanmış bir lens. Kondansatör , aydınlatmanın kalitesini ve yoğunluğunu yönetmek için diyafram ve/veya filtreler gibi başka özellikler de içerebilir . Karanlık alan , faz kontrastı ve diferansiyel girişim kontrast mikroskopisi gibi aydınlatma teknikleri için ek optik bileşenlerin ışık yolunda tam olarak hizalanması gerekir.

Büyütme

Bileşik optik mikroskobun gerçek gücü veya büyütmesi , oküler ( mercek ) ve objektif merceğin güçlerinin ürünüdür . Oküler ve objektifin maksimum normal büyütmeleri sırasıyla 10× ve 100× olup, nihai 1.000× büyütme sağlar.

Büyütme ve mikrograflar

Bir mikrograf çekmek için bir kamera kullanırken , görüntünün etkili büyütmesi, görüntünün boyutunu hesaba katmalıdır. Bu, bir film negatifinden bir baskıda mı yoksa bir bilgisayar ekranında dijital olarak mı görüntülendiğinden bağımsızdır .

Fotoğraf filmi kameraları söz konusu olduğunda hesaplama basittir; Nihai büyütme aşağıdakilerin ürünüdür: objektif lens büyütmesi, kamera optiği büyütmesi ve negatife göre film baskısının büyütme faktörü. Büyütme faktörünün tipik bir değeri yaklaşık 5×'dir ( 35 mm film ve 15 × 10 cm (6 × 4 inç) baskı için).

Dijital kameralar söz konusu olduğunda, CMOS veya CCD dedektöründeki piksellerin boyutu ve ekrandaki piksellerin boyutu bilinmelidir. Detektörden ekrandaki piksellere kadar olan büyütme faktörü daha sonra hesaplanabilir. Bir film kamerasında olduğu gibi, nihai büyütme şu ürünlerin ürünüdür: objektif lens büyütmesi, kamera optiği büyütmesi ve büyütme faktörü.

Operasyon

aydınlatma teknikleri

Bir numuneden gelişmiş bir kontrast görüntüsü oluşturmak için ışık yolunu değiştiren birçok teknik mevcuttur . Numuneden artırılmış kontrast oluşturmak için başlıca teknikler arasında çapraz polarize ışık , karanlık alan , faz kontrastı ve diferansiyel girişim kontrast aydınlatması bulunur. Yeni bir teknik ( Sarfus ), nanometrik numunelerin görselleştirilmesi için çapraz polarize ışık ve spesifik kontrastlı slaytları birleştirir .

Diğer teknikler

Modern mikroskoplar, bir örneğin iletilen ışık görüntüsünün gözlemlenmesinden daha fazlasını sağlar; diğer veri türlerini çıkarmak için kullanılabilecek birçok teknik vardır. Bunların çoğu, temel bir bileşik mikroskoba ek olarak ek ekipman gerektirir.

  • Yansıyan ışık veya olay aydınlatması (yüzey yapılarının analizi için)
  • Floresan mikroskopisi, her ikisi de:
  • Mikrospektroskopi (UV-görünür bir spektrofotometrenin bir optik mikroskopla entegre edildiği)
  • ultraviyole mikroskopisi
  • Yakın Kızılötesi mikroskopi
  • Kontrast geliştirme ve sapma azaltma için çoklu transmisyon mikroskopisi.
  • Otomasyon (büyük bir numunenin otomatik olarak taranması veya görüntü alınması için)

Uygulamalar

Islak montaj tekniği kullanılarak optik mikroskoptan alınan , numuneyi bir cam slayt üzerine yerleştirip bir tuz çözeltisi ile karıştırarak tıbbi yayma testinde hücrelerin 40x büyütmeli görüntüsü

Optik mikroskopi, mikroelektronik, nanofizik, biyoteknoloji, farmasötik araştırma, mineraloji ve mikrobiyolojide yaygın olarak kullanılmaktadır.

Optik mikroskopi, tıbbi tanı için kullanılır , bu alan dokularla uğraşırken histopatoloji olarak adlandırılır veya serbest hücreler veya doku parçaları üzerinde smear testlerinde kullanılır .

Endüstriyel kullanımda binoküler mikroskoplar yaygındır. Gerçek derinlik algısı gerektiren uygulamaların yanı sıra , çift göz merceği kullanımı , bir mikroskop istasyonunda uzun iş günleriyle ilişkili göz yorgunluğunu azaltır . Belirli uygulamalarda, uzun çalışma mesafesi veya uzun odaklı mikroskoplar faydalıdır. Bir öğenin bir pencerenin arkasında incelenmesi gerekebilir veya endüstriyel konular hedef için tehlike oluşturabilir. Bu tür optikler, yakın odak yeteneklerine sahip teleskoplara benzer.

Hassas ölçüm için ölçüm mikroskopları kullanılır. İki temel türü vardır. Biri, odak düzleminde mesafelerin ölçülmesine izin vermek için derecelendirilmiş bir retikül içerir . Diğer (ve daha eski) tip, basit artı işaretlerine ve konuyu mikroskoba göre hareket ettirmek için bir mikrometre mekanizmasına sahiptir.

Çok küçük, taşınabilir mikroskoplar, laboratuvar mikroskobunun bir yük olacağı yerlerde bir miktar kullanım bulmuştur.

sınırlamalar

Ernst Abbe için bir anıt üzerinde taşla belirlenen kırınım sınırı .

İletilen ışıkla çok yüksek büyütmelerde, nokta nesneler kırınım halkaları ile çevrili bulanık diskler olarak görülür . Bunlara Havalı diskler denir . Çözme gücü mikroskop (diğer bir deyişle veya farklı ve ayrı bir şekilde, bitişik yapısal ayrıntıları ortaya çıkarmak için mikroskop yeteneği) yakın bir şekilde aralıklandınlmış Havalı diskler arasında ayırım yeteneği olarak alınır. İnce ayrıntıları çözme yeteneğini sınırlayan kırınım etkileridir. Difraksiyon modellerinin kapsam ve büyüklüğü her iki etkilenen dalga boyu arasında ışık (A), objektif lens ve imalatı için kullanılan bir kırılma malzemeler sayısal açıklık objektif merceğinin (NA). Bu nedenle, kırınım sınırı olarak bilinen nesnel alandaki ayrı noktaları çözmenin imkansız olduğu sonlu bir sınır vardır . Tüm optik kurulumdaki optik sapmaların ihmal edilebilir olduğunu varsayarsak, çözünürlük d şu şekilde ifade edilebilir:

Genellikle, yeşil ışığa karşılık gelen 550 nm'lik bir dalga boyu varsayılır . Dış ortam olarak hava ile en yüksek pratik NA 0,95'tir ve yağ ile 1,5'e kadardır. Pratikte geleneksel lenslerle elde edilebilecek en düşük d değeri yaklaşık 200 nm'dir. Çoklu ışık saçılımını kullanan yeni bir lens türü, çözünürlüğü 100 nm'nin altına yükseltmeye izin verdi.

Çözünürlük sınırını aşmak

Yukarıda açıklanan iletilen ışık sınırından daha yüksek çözünürlüklere ulaşmak için birden fazla teknik mevcuttur. 1979'da Courjon ve Bulabois tarafından tarif edildiği gibi holografik teknikler, deneysel analizlerinde çözünürlük sınırlı olmasına rağmen, bu çözünürlük sınırını da kırma yeteneğine sahiptir.

Floresan numuneleri kullanarak daha fazla teknik mevcuttur. Örnekler arasında Vertico SMI , kaybolan dalgalar kullanan yakın alan taramalı optik mikroskop ve uyarılmış emisyon tükenmesi sayılabilir . 2005 yılında, tek bir molekülü tespit edebilen bir mikroskop, bir öğretim aracı olarak tanımlandı.

Son on yıldaki önemli ilerlemeye rağmen, kırınım sınırını aşma teknikleri sınırlı ve uzmanlaşmıştır.

Çoğu teknik, yanal çözünürlükteki artışlara odaklanırken, aşırı ince numunelerin analizine izin vermeyi amaçlayan bazı teknikler de vardır. Örneğin sarfus yöntemleri, ince numuneyi kontrast arttırıcı bir yüzeye yerleştirir ve böylece 0,3 nanometre kadar ince filmlerin doğrudan görselleştirilmesine olanak tanır.

8 Ekim 2014'te, Nobel Kimya Ödülü , süper çözülmüş floresan mikroskobunun geliştirilmesi için Eric Betzig , William Moerner ve Stefan Hell'e verildi .

Yapılandırılmış aydınlatma SMI

SMI (uzaysal modülasyonlu aydınlatma mikroskobu), nokta yayılma fonksiyonu (PSF) mühendisliğinin hafif optik bir işlemidir . Bunlar , optik çözünürlüğü artırmak , aydınlatıcı ışığın dalga boyuna göre küçük olan flüoresan nesnelerin mesafe ölçümlerinin hassasiyetini en üst düzeye çıkarmak veya diğer yapısal parametreleri çıkarmak için bir mikroskobun PSF'sini uygun bir şekilde değiştiren işlemlerdir . nanometre aralığı.

Yerelleştirme mikroskopisi SPDMphymod

2010'dan itibaren 3D Çift Renkli Süper Çözünürlüklü Mikroskopi Kremi
Göğüs hücrelerinde Her2 ve Her3 ile 3D çift renkli süper çözünürlüklü mikroskopi, standart boyalar: Alexa 488, Alexa 568 LIMON

SPDM (spektral hassas mesafe mikroskobu), temel lokalizasyon mikroskobu teknolojisi, ışık mikroskobu için teorik çözünürlük sınırının çok altında "optik olarak izole edilmiş" parçacıklar (örn. moleküller) üzerinde konum, mesafe ve açı ölçümlerine izin veren floresan mikroskobunun hafif optik bir işlemidir . "Optik olarak izole edilmiş", belirli bir zamanda, geleneksel optik çözünürlükle (tipik olarak yaklaşık 200–250 nm çap ) belirlenen bir boyut bölgesi içindeki tek bir partikül/molekülün kaydedildiği anlamına gelir. Bu, böyle bir bölge içindeki moleküllerin tümü farklı spektral işaretleyiciler (örneğin farklı renkler veya farklı parçacıkların ışık emisyonundaki diğer kullanılabilir farklılıklar) taşıdığında mümkündür .

GFP , Alexa boyaları, Atto boyaları, Cy2/Cy3 ve floresan molekülleri gibi birçok standart floresan boyalar , belirli foto-fiziksel koşulların mevcut olması koşuluyla lokalizasyon mikroskopisi için kullanılabilir. Bu sözde SPDMphymod (fiziksel olarak değiştirilebilir floroforlar) teknolojisini kullanarak, nanogörüntüleme için uygun yoğunlukta tek bir lazer dalga boyu yeterlidir.

3D süper çözünürlüklü mikroskopi

Standart floresan boyalarla 3D süper çözünürlüklü mikroskopi, standart floresan boyalar SPDMphymod ve yapılandırılmış aydınlatma SMI için lokalizasyon mikroskopisi kombinasyonu ile elde edilebilir.

STED

Bir hücre içindeki aktin filamentlerinin uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskopi görüntüsü.

Uyarılmış emisyon tükenmesi , kırınım sınırını aşan daha yüksek çözünürlüğün nasıl mümkün olduğunun basit bir örneğidir, ancak büyük sınırlamaları vardır. STED, bir numunedeki küçük bir floresan molekül alt popülasyonunda floresan indüklemek için ışık darbelerinin bir kombinasyonunu kullanan bir floresan mikroskopi tekniğidir. Her molekül, görüntüde kırınımla sınırlı bir ışık noktası üretir ve bu noktaların her birinin merkezi, molekülün konumuna karşılık gelir. Floresan moleküllerin sayısı düşük olduğundan, ışık noktalarının üst üste gelmesi olası değildir ve bu nedenle doğru bir şekilde yerleştirilebilir. Bu işlem daha sonra görüntüyü oluşturmak için birçok kez tekrarlanır. Max Planck Biyofizik Kimya Enstitüsü'nden Stefan Hell , STED mikroskobu ve ilgili metodolojileri geliştirmesi nedeniyle 2006'da 10. Alman Gelecek Ödülü'ne ve 2014'te Nobel Kimya Ödülü'ne layık görüldü.

alternatifler

Görünür ışığın kırınım sınırı tarafından belirlenen sınırlamaların üstesinden gelmek için, diğer dalgaları kullanan başka mikroskoplar tasarlanmıştır.

Daha yüksek frekanslı dalgaların madde ile sınırlı etkileşime sahip olduğuna dikkat etmek önemlidir, örneğin yumuşak dokular X ışınlarına nispeten şeffaftır ve bu da farklı kontrast kaynakları ve farklı hedef uygulamaları ile sonuçlanır.

Işık yerine elektronların ve X-ışınlarının kullanılması çok daha yüksek çözünürlüğe izin verir - radyasyonun dalga boyu daha kısa olduğundan kırınım limiti daha düşüktür. Kısa dalga boylu sondayı tahribatsız hale getirmek için, atomik ışın görüntüleme sistemi ( atomik nanoskop ) önerilmiş ve literatürde geniş çapta tartışılmıştır, ancak henüz geleneksel görüntüleme sistemleri ile rekabet halinde değildir.

STM ve AFM, numune yüzeyi üzerinde taranan küçük bir sonda kullanan tarama sondası teknikleridir. Bu durumlarda çözüm, sondanın boyutuyla sınırlıdır; mikro işleme teknikleri, uç yarıçapı 5-10 nm olan problar üretebilir.

Ek olarak, elektron veya X-ışını mikroskobu gibi yöntemler, canlı ve biyolojik numuneler için kullanımlarını sınırlayan bir vakum veya kısmi vakum kullanır ( çevresel taramalı elektron mikroskobu hariç ). Tüm bu tür enstrümanlar için gerekli olan numune odaları, numune boyutunu da sınırlar ve numune manipülasyonu daha zordur. Bu yöntemlerle yapılan görüntülerde renk görülmez, bu nedenle bazı bilgiler kaybolur. Gibi molekül veya atomik etkileri, araştırılırken Bununla birlikte gerekli olan yaşlandırma olarak alüminyum alaşımları veya mikro ait polimerler .

Ayrıca bakınız

Referanslar

Alıntılanan kaynaklar

  • Van Helden, Albert; Dupre, Sven; Van Gent, Rob (2011). Teleskobun Kökenleri . Amsterdam Üniversitesi Yayınları. ISBN'si 978-9069846156.

daha fazla okuma

  • "Metalografik ve Materyalografik Numune Hazırlama, Işık Mikroskopisi, Görüntü Analizi ve Sertlik Testi", Kay Geels, Struers A/S ile işbirliği içinde, ASTM International 2006.
  • "Işık Mikroskopisi: Devam eden çağdaş bir devrim" , Siegfried Weisenburger ve Vahid Sandoghdar, arXiv:1412.3255 2014.

Dış bağlantılar