Sinir yönlendirme kanalı - Nerve guidance conduit

Bir sinir yönlendirme kanalı ( otogreftin aksine yapay sinir kanalı veya yapay sinir grefti olarak da adlandırılır ), sinir rejenerasyonunu kolaylaştırmak için aksonal yeniden büyümeyi yönlendirmenin yapay bir yoludur ve sinir yaralanmaları için çeşitli klinik tedavilerden biridir . Kopmuş bir sinirin iki kütüğünün doğrudan dikilmesi gerilim olmadan gerçekleştirilemediğinde, periferik sinir yaralanmaları için standart klinik tedavi otolog sinir greftidir . Otolog sinir greftlemesinde donör dokusunun sınırlı mevcudiyeti ve fonksiyonel iyileşme nedeniyle, nöral doku mühendisliği araştırmaları, özellikle büyük defektler için alternatif bir tedavi olarak biyoyapay sinir kılavuz kanallarının geliştirilmesine odaklanmıştır. Omurilikte sinir onarımı için de benzer teknikler araştırılmaktadır, ancak merkezi sinir sisteminde sinir rejenerasyonu daha büyük bir zorluk teşkil etmektedir çünkü aksonları kendi doğal ortamlarında kayda değer ölçüde yenilenmemektedir.

Yapay kanalların oluşturulması aynı zamanda entübasyon olarak da bilinir, çünkü sinir uçları ve araya giren boşluk biyolojik veya sentetik malzemelerden oluşan bir tüp içine alınır. Konduit ister biyolojik bir tüp, sentetik tüp veya doku mühendisliği yapılmış kanal şeklinde olsun, sinir boşluğunun proksimal ve distal uçları arasındaki nörotropik ve nörotrofik iletişimi kolaylaştırmalı, dış inhibitör faktörleri bloke etmeli ve aksonal için fiziksel bir rehberlik sağlamalıdır. yeniden büyüme. Bir sinir yönlendirme kanalının en temel amacı, doku oluşumunu teşvik edecek koşullar altında fiziksel, kimyasal ve biyolojik ipuçlarını birleştirmektir.

Biyolojik tüpler yapmak için kullanılan malzemeler arasında kan damarları ve iskelet kasları bulunurken, emilmeyen ve biyolojik olarak emilebilen sentetik tüpler sırasıyla silikon ve poliglikolidden yapılmıştır. Doku mühendisliği yapılmış sinir yönlendirme kanalları birçok unsurun bir kombinasyonudur: iskele yapısı, iskele malzemesi, hücresel terapiler, nörotrofik faktörler ve biyomimetik malzemeler. Hangi fiziksel, kimyasal ve biyolojik ipuçlarının kullanılacağının seçimi, akson rejenerasyonu için en arzu edilen ortamı yaratmada kritik olan sinir ortamının özelliklerine dayanır. Malzeme seçimini kontrol eden faktörler arasında biyouyumluluk , biyolojik olarak parçalanabilirlik , mekanik bütünlük, sinir büyümesi sırasında kontrol edilebilirlik, implantasyon ve sterilizasyon yer alır.

İskele topografyası

Olarak doku mühendisliği , iskele yapısı üç ana seviyeleri olarak kabul edilmektedir:

  • üst yapı, iskelenin genel şekli;
  • mikro yapı, yüzeyin hücresel düzeydeki yapısı; ve
  • nanoyapı, yüzeyin hücre altı düzeydeki yapısı.

üst yapı

Bir kanalın veya iskelenin üst yapısı, sinir dokusu oluşumu için in vivo koşulları simüle etmek için önemlidir . Esas olarak doku büyümesini ve oluşumunu yönlendirmekten sorumlu olan hücre dışı matris, iç içe geçmiş birçok lifli molekül tarafından oluşturulan karmaşık bir üst yapıya sahiptir. Yapay üst yapı oluşturmanın yolları, ısıya duyarlı hidrojellerin, uzunlamasına yönlendirilmiş kanalların, uzunlamasına yönlendirilmiş liflerin, streç büyütülmüş aksonların ve nano lifli yapı iskelelerinin kullanımını içerir.

Termo duyarlı hidrojeller

Olarak , travmatik beyin hasarı (TBI), zararlı bir dizi olay, düzensiz şekilli lezyon oyuğun oluşumuna neden hücre ölümü ve genel fonksiyon bozukluğu için bu öne başlatılır. Ortaya çıkan kavite, invaziv implantasyon gerektiğinden ve genellikle iskele kavite şekline uymadığından, doku mühendisliği yapılmış iskeleler için birçok probleme neden olur. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, termo-duyarlı hidrojeller , yerinde jelleşme ve kavite şekline uyum yoluyla implantasyonu kolaylaştırmak için oda ve fizyolojik sıcaklıklardaki farklılıkların neden olduğu çözelti-jelasyon (sol-jel) geçişlerine tabi tutulacak şekilde tasarlanmıştır. neden oldu, minimal invaziv bir şekilde enjekte edilmelerine izin verdi.

Metilselüloz (MC), optimum sıcaklık aralığında iyi tanımlanmış sol-jel geçişlerine sahip bir malzemedir. MC jelleşmesi, sıcaklık arttıkça molekül içi ve moleküller arası hidrofobik etkileşimlerdeki bir artış nedeniyle oluşur. Sol-jel geçişi, elastik modülün viskoz modüle eşit olduğu sıcaklık olan düşük kritik çözelti sıcaklığı (LCST) tarafından yönetilir. İskele implantasyon üzerine jelleşecek ve minimal invaziv bir teslimat yaratacaksa, LCST fizyolojik sıcaklığı (37 °C) aşmamalıdır. Bir TBI lezyon boşluğuna veya periferik sinir yönlendirme kanalına implantasyonun ardından, MC minimal bir inflamatuar yanıt ortaya çıkarır. MC solüsyonunun LCST'sinin altındaki sıcaklıklarda bir viskoziteye sahip olması, minimal invaziv uygulama için de çok önemlidir, bu da in vivo uygulamalarda implantasyon için küçük bir iğne ile enjekte edilmesini sağlar . MC, intra-optik ve oral farmasötik tedaviler için bir dağıtım maddesi olarak başarıyla kullanılmıştır. MC'nin bazı dezavantajları, protein adsorpsiyonu ve nöronal hücresel yapışma için sınırlı eğilimini, onu biyoaktif olmayan bir hidrojel haline getirmesini içerir. Bu dezavantajlardan dolayı, nöral doku rejenerasyonunda MC'nin kullanımı, hücre yapışmasını arttırmak için biyolojik olarak aktif bir grubun polimer omurgasına bağlanmasını gerektirir.

Bir başka ısıya duyarlı jel, kitosan ile gliserofosfat (GP) tuzu birleştirilerek oluşturulan jeldir . Bu çözelti, 37 °C'nin üzerindeki sıcaklıklarda jelleşme yaşar. Kitosan/GP'nin jelleşmesi oldukça yavaştır, başlangıçta ayarlanması yarım saat ve tamamen stabilize olması 9 saat daha sürer. Jel gücü, kitosan konsantrasyonuna bağlı olarak 67 ila 1572 Pa arasında değişir; bu aralığın alt ucu beyin dokusunun sertliğine yaklaşır. Kitosan/GP in vitro başarı göstermiştir , ancak sinir hücresi ekini güçlendirmek için polilisin ilavesi gereklidir. Polilisin, difüzyonunu önlemek için kitosan'a kovalent olarak bağlanmıştır. Polilisin, pozitif doğası ve nörit büyümesini destekleyen yüksek hidrofilikliği nedeniyle seçilmiştir . Nöron sağkalımı iki katına çıktı, ancak nörit büyümesi eklenen polilisin ile değişmedi.

Boyuna yönlendirilmiş kanallar

Boyuna yönlendirilmiş kanallar, yenilenen aksonlara doğrudan iskele boyunca büyümek için iyi tanımlanmış bir kılavuz vermek için bir kanala eklenebilen makroskopik yapılardır. Mikrotübüler kanal mimarisine sahip bir iskelede , yenilenen aksonlar, normalde periferik sinirlerin endonöral tüplerinden uzanacakları gibi, açık uzunlamasına kanallar boyunca uzanabilirler. Ek olarak, kanallar hücre teması için uygun yüzey alanını arttırır. Kanallar genellikle bir iğne, tel veya ikinci polimer çözeltisinin bir polimer iskelesi içine yerleştirilmesiyle oluşturulur; ana polimerin şeklini stabilize ettikten sonra, kanalları oluşturmak için iğne, tel veya ikinci polimer çıkarılır. Tipik olarak birden çok kanal oluşturulur; bununla birlikte, iskele, sadece bir içi boş tüp olan sadece bir büyük kanaldan oluşabilir.

Wang ve diğerleri tarafından bir kalıplama tekniği oluşturuldu. kitosan'dan çok kanallı bir iç matris ve bir dış tüp duvarı ile bir sinir yönlendirme kanalı oluşturmak için. 2006 yılında yaptıkları çalışmada, Wang ve ark. akupunktur iğneleri içi boş bir kitosan tüpünden geçirilir ve burada CAD kullanılarak oluşturulan yamalar her iki uçta sabitlenerek yerinde tutulur. Daha sonra tüpe bir kitosan çözeltisi enjekte edilir ve katılaştırılır, ardından iğneler çıkarılır ve uzunlamasına yönlendirilmiş kanallar oluşturulur. Daha sonra 400 µm çapında akupunktur iğneleri kullanılarak 21 kanallı karakterizasyon için temsili bir iskele oluşturuldu. Mikroskop altında yapılan incelemede, kanalların hafif düzensizlikler ile yaklaşık olarak dairesel olduğu bulundu; tüm kanallar, dış boru duvarının iç çapı ile hizalanmıştır. Mikro-CT görüntüleme ile kanalların iskelenin tüm uzunluğu boyunca geçtiği doğrulandı. Su absorpsiyonu altında, iskelenin iç ve dış çapları daha büyük hale geldi, ancak kanal çapları önemli ölçüde değişmedi, bu da nörit uzantısını yönlendiren iskele şeklini korumak için gerekli. İç yapı, tek başına içi boş bir tüpe kıyasla basınç mukavemetinde bir artış sağlar, bu da yapı iskelesinin büyüyen nöritler üzerine çökmesini önleyebilir. Neuro-2a hücreleri, yapı iskelesinin iç matrisi üzerinde büyüyebildiler ve kanallar boyunca yönlendirildiler. Bu yöntem sadece kitosan üzerinde test edilmiş olmasına rağmen, diğer malzemelere göre uyarlanabilir.

liyofilizasyon ve tel ısıtma işlemi, Huang ve diğerleri tarafından geliştirilen, uzunlamasına yönlendirilmiş kanallar oluşturmanın başka bir yöntemidir. (2005). Bir kitosan ve asetik asit çözeltisi, bir sıvı nitrojen tuzağı içinde nikel-bakır (Ni-Cu) teller etrafında donduruldu ; daha sonra teller ısıtıldı ve çıkarıldı. Ni-Cu teller yüksek direnç seviyelerine sahip oldukları için seçilmiştir. Asetik asidi süblimleştirmek için sıcaklık kontrollü liyofilizatörler kullanıldı. Kanalların birleştiğine veya ayrıldığına dair hiçbir kanıt yoktu. Liyofilizasyondan sonra, iskele boyutları küçüldü ve kanalların kullanılan telden biraz daha küçük olmasına neden oldu. İskeleler, gözenekli yapı üzerinde dramatik etkileri olan bir baz kullanılarak fizyolojik bir pH değerine nötrleştirildi. Daha zayıf tabanlar, gözenekli yapıyı tek tip tuttu, ancak daha güçlü taban, onu kontrol edilemez hale getirdi. Burada kullanılan teknik, diğer polimerleri ve çözücüleri barındırmak için biraz değiştirilebilir.

Boyuna yönlendirilmiş kanallar oluşturmanın başka bir yolu, bir polimerden gömülü uzunlamasına yönlendirilmiş fiberler ile başka bir polimerden bir kanal oluşturmaktır; daha sonra uzunlamasına yönlendirilmiş kanallar oluşturmak için lifleri seçici olarak çözün. Polikaprolakton (PCL) lifleri bir (Hidroksietil)metakrilat (HEMA) iskelesine gömüldü . PCL, poli (laktik asit) (PLA) ve poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) yerine seçildi, çünkü HEMA'da çözünmez, ancak asetonda çözünür . Bu önemlidir, çünkü ana kanal malzemesi olarak HEMA ve polimer liflerini seçici olarak çözmek için aseton kullanılmıştır. Ekstrüde edilmiş PCL fiberleri bir cam tüpe yerleştirildi ve HEMA solüsyonu enjekte edildi. Oluşturulan kanalların sayısı partiden partiye tutarlıydı ve daha kontrollü bir PCL elyaf ekstrüzyon sistemi yaratılarak elyaf çapındaki değişimler azaltılabilirdi. Oluşan kanalların sürekli ve homojen olduğu, porozite varyasyonlarının incelenmesiyle doğrulanmıştır. Bu işlem güvenli, tekrarlanabilir ve kontrol edilebilir boyutlara sahiptir. Yu ve Shoichet (2005) tarafından yürütülen benzer bir çalışmada, HEMA, bir P(HEMA-ko-AMEA) jeli oluşturmak için AEMA ile kopolimerize edilmiştir. Polikaprolakton (PCL) lifleri jele gömüldü ve daha sonra kanallar oluşturmak için sonikasyon ile aseton ile seçici olarak çözüldü. %1 AEMA ile karışım halindeki HEMA'nın en güçlü jelleri oluşturduğu bulundu. Kanalsız yapı iskeleleri ile karşılaştırıldığında, 82-132 kanalın eklenmesi, yüzey alanında yaklaşık 6-9 kat artış sağlayabilir, bu da temas aracılı ipuçlarına bağlı rejenerasyon çalışmaları için avantajlı olabilir.

Itoh et al. (2003), yengeçlerden elde edilen kitosan tendonları kullanılarak oluşturulan uzunlamasına yönlendirilmiş tek bir büyük kanaldan oluşan bir iskele geliştirmiştir. Tendonlar yengeçlerden (Macrocheira kaempferi) toplandı ve proteinleri uzaklaştırmak ve daha sonra tendon kitosan olarak bilinen tendon kitini deasetilize etmek için tekrar tekrar sodyum hidroksit solüsyonu ile yıkandı . Üçgen şekilli kesitli (her bir kenarı 2.1 mm uzunluğunda) paslanmaz çelik bir çubuk, dairesel şekilli kesitli (çap: 2 mm; uzunluk: 15 mm) içi boş bir tendon kitosan tüpüne yerleştirildi. Dairesel şekilli ve üçgen şekilli borular karşılaştırıldığında, üçgen boruların geliştirilmiş mekanik mukavemete sahip olduğu, şekillerini daha iyi tuttuğu ve mevcut yüzey alanını arttırdığı bulundu. Bu, tek bir kanal oluşturmak için etkili bir yöntem olsa da, hücresel büyüme için çok kanallı iskeleler kadar fazla yüzey alanı sağlamaz.

Newman et al. (2006), bir kolajen-TERP iskelesine ( poli(N-izopropilakrilamid) (PNiPAAm) terpolimeri ile çapraz bağlanmış kolajen) iletken ve iletken olmayan lifler yerleştirdi . Lifler, küçük bir cam slayt üzerine sıkıca sarılarak ve bir kolajen-TERP solüsyonu ile başka bir cam slayt arasına sıkıştırılarak gömüldü; cam slaytlar arasındaki aralayıcılar jel kalınlığını 800 um'ye ayarlar. İletken lifler karbon fiber ve Kevlar idi ve iletken olmayan fiberler naylon-6 ve tungsten teldi. Nöritler, karbon fiber üzerinde kalın demetler halinde her yöne uzanır; ancak diğer üç lifle, nöritler ince ağ benzeri biçimlerde uzar. Nöritler, karbon ve Kevlar lifleri üzerinde hiçbir yönlü büyüme göstermediler, ancak naylon-6 lifleri boyunca ve bir dereceye kadar tungsten teli boyunca büyüdüler. Tungsten tel ve naylon-6 fiber yapı iskeleleri, yüzey boyunca büyümeye ek olarak fiber-jel ara yüzünün yakınında jelin içinde nöritlerin büyümesine sahipti. Kevlar dışındaki tüm fiber jeller, fiber olmayan jellere kıyasla nörit uzamasında önemli bir artış gösterdi. İletken olmayan ve iletken lifler arasında nörit uzantısında hiçbir fark yoktu.

2005 yılında yaptıkları çalışmada Cai ve ark. içi boş poli(laktik asit) (PLA) ve silikon tüplere Poli (L-laktik asit) (PLLA) mikrofilamentleri ekledi . Mikrofiber kılavuzluk özellikleri, daha iyi uzunlamasına yönlendirilmiş hücre göçünü ve aksonal rejenerasyonu teşvik eden daha küçük çaplara sahip fiber çapı ile ters orantılıydı. Mikrofiberler ayrıca periferik sinir onarımı sırasında miyelinasyonu destekledi.

Gerdirilmiş aksonlar

Olgun akson yollarının, akson silindirinin orta kısmında mekanik olarak gerildiğinde büyüme gösterdiği gösterilmiştir. Bu tür bir mekanik gerdirme, dört ana bileşenden oluşan özel bir akson gerdirme-büyütme biyoreaktörü tarafından uygulandı: özel olarak tasarlanmış akson genişleme odası, doğrusal hareket masası, kademeli motor ve kontrolör. Sinir dokusu kültürü, gaz değişimi için bir port ve iki soma grubunu (nöron hücre gövdeleri) ayırabilen ve böylece aksonlarını uzatabilen çıkarılabilir bir gerdirme çerçevesi ile genişleme odası içine yerleştirilir. Kolajen jel, çıplak gözle görülebilen daha büyük, gerilerek büyütülmüş akson yollarının büyümesini teşvik etmek için kullanıldı. Kollajen kaplama nedeniyle büyüme artışının iki nedeni vardır: 1) kollajen kuruduktan sonra kültür hidrofobik hale geldi, bu da daha yoğun bir nöron konsantrasyonunun büyümesine izin verdi ve 2) kollajen kaplama, iki uzama substratı boyunca engelsiz bir kaplama oluşturdu . Tarafından incelenmesi , taramalı elektron mikroskobu ve TEM bağlı streç akson incelme hiçbir işaret gösterdi ve hücre iskeleti normal ve sağlam olduğu ortaya çıktı. Gerilerek büyütülen akson yolları, büyüme tamamlandıktan sonra aksonları bir iskeleye aktarma ihtiyacını ortadan kaldırarak, transplantasyon için doğrudan silindirik bir yapıya dönüştürülebilen biyouyumlu bir zar üzerinde kültürlendi. Uzatılarak büyütülen aksonlar, sadece 8 günlük iklimlendirmeden sonra benzeri görülmemiş 1 cm/gün oranında büyüyebildiler; bu, büyüme konisi uzantısı için ölçülen 1 mm/gün maksimum büyüme oranından çok daha fazladır. 1 mm/gün hızı da nörofilamentler gibi yapısal elemanlar için ortalama taşıma hızıdır.

Nanofiber iskeleler

Nano ölçekli lifler üzerine yapılan araştırmalar, yönlü büyümeyi ve yenilenmeyi teşvik etmek için in vivo hücre dışı ortamı taklit etmeye çalışır . Nanolifli yapı iskeleleri oluşturmak için üç farklı yöntem, kendi kendine montaj, faz ayırma ve elektro-eğirmedir. Bununla birlikte, nanolifli yapı iskeleleri oluşturmak için başka birçok yöntem vardır.

Nano lifli yapı iskelelerinin kendi kendine montajı, yalnızca liflerin kendileri kendi kendine montaj için tasarlandığı zaman meydana gelebilir. İskele liflerinin kendi kendine montajını yürütmenin yaygın bir yolu, suda hidrofobik kısmın kendiliğinden montajı tahrik etmesi için amfifilik peptitleri kullanmaktır. Amfifilik peptitlerin dikkatlice hesaplanmış mühendisliği, kendiliğinden oluşan matris üzerinde hassas kontrol sağlar. Kendinden montaj, hem sıralı hem de sırasız topografyalar oluşturabilir. Philips et al. (2005) tarafından geliştirilen ve test edilen in vitro ve in vivo kendi kendine hizalanmış kolajen - Schwann hücresi DRG nevrit uzatma hizalama izin matris, in vitro . Kollajen jeller, üç boyutlu doku kültürü için substratlar olarak yaygın olarak kullanılmıştır . Hücreler, hücre iskeleti düzeneğini ve hücre hareketliliğini başlatan kolajen ile integrin aracılı bağlantılar oluşturabilir. Hücreler kolajen lifleri boyunca hareket ettikçe jeli daraltan kuvvetler üretirler. Kollajen lifleri her iki uçta birbirine bağlandığında, hücre tarafından oluşturulan kuvvetler tek eksenli gerginlik oluşturarak hücrelerin ve kolajen liflerinin hizalanmasına neden olur. Bu matrisin avantajları basitliği ve hazırlanma hızıdır. Çözünür plazma fibronektin ayrıca viskoz bir çözelti içinde doğrudan mekanik kesme işlemine tabi tutulduğunda kararlı çözünmeyen lifler halinde kendi kendine birleşebilir . Philips et al. (2004), daha iyi bir agregasyona neden olan yeni bir kesme agregasyonu yöntemini araştırdı. Mekanik kesme, 0.2 ml'lik bir bolusu forseps ile 3 cm'ye sürükleyerek oluşturuldu; fibronektin, bir ultrafiltrasyon hücresinde hızla hareket eden arayüzde çözünmeyen lifler halinde toplanır. Bu lif kümelenmesi için önerilen mekanizma, liflerin yanal paketlenmesine ve protein kümelenmesine yol açan mekanik kesme kuvveti altında protein uzaması ve uzamasıdır. Philips et al. yüksek viskoziteli bir fibronektin jelin gerilmesiyle üretilen mekanik kesmenin yapısında önemli değişikliklere neden olduğunu ve tek eksenli uzatma yoluyla uygulandığında viskoz bir fibronektin jelin yönlendirilmiş fibröz fibronektin agregatları oluşturduğunu gösterdi; ek olarak, lifli agregalar azaltılmış bir çözünürlüğe sahiptir ve çeşitli hücre tiplerini in vitro destekleyebilir.

Faz ayrımı, özel ekipman kullanılmadan üç boyutlu mikrometre altı fiber yapı iskelelerinin oluşturulmasına izin verir. Faz ayrımında yer alan beş adım, polimer çözünmesi, faz ayrımı ve jelleşme, jelden solvent ekstraksiyonu, suda dondurma ve dondurarak kurutmadır. Nihai ürün, sürekli bir fiber ağdır. Faz ayrımı, birçok farklı uygulamaya uyacak şekilde değiştirilebilir ve gözenek yapısı, tüm süreci sıvı-sıvıdan katı-sıvıya değiştirebilen farklı çözücüler kullanılarak değiştirilebilir. Gözeneklilik ve lif çapı, polimerin başlangıç ​​konsantrasyonu değiştirilerek de değiştirilebilir; daha yüksek bir başlangıç ​​konsantrasyonu, daha az gözenek ve daha büyük lif çaplarına yol açar. Bu teknik, çapları tip I kollajen lif çaplarına ulaşan lif ağları oluşturmak için kullanılabilir. Oluşturulan lifli ağ rastgele yönlendirilmiştir ve şimdiye kadar lifleri organize etmeye çalışmak için herhangi bir çalışma yapılmamıştır. Faz ayırma, kolaylıkla yüksek oranda gözenekli nanolifli yapı iskeleleri oluşturmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir.

Electrospinning , sentetik sinir kılavuz kanallarının geliştirilmesi için sağlam bir platform sağlar. Elektro eğirme, değişen kimya ve topografya ile kontrollü boyutlarda yapı iskeleleri oluşturmaya hizmet edebilir. Ayrıca, partiküller, büyüme faktörleri ve hatta hücreler dahil olmak üzere lifler içinde farklı malzemeler kapsüllenebilir. Elektro-eğirme, bir damla polimer eriyiği veya çözeltisini elektriksel olarak yükleyerek ve bir kılcal damardan askıya alarak lifler oluşturur. Daha sonra, kapilerin bir ucuna yük yüzey gerilimini aşana kadar bir elektrik alanı uygulanarak uzayan ve incelen bir polimer jeti oluşturulur. Bu polimer jeti, bir Taylor konisi olarak boşalır ve çözücü jetlerden buharlaştıkça çözücü olarak topraklanmış bir yüzey üzerinde toplanan elektrik yüklü polimerleri geride bırakır. Elyaflar, 3 nm'den az ile 1 µm arasında değişen çaplarda eğrilmiştir. İşlem, polimer türü, polimer moleküler ağırlığı ve çözelti özellikleri gibi sistem parametrelerinden ve akış hızı, voltaj, kapiler çapı, toplayıcı ile kapiler arasındaki mesafe ve kollektörün hareketi gibi işlem parametrelerinden etkilenir. Oluşturulan lifli ağ düzensizdir ve yüksek gözenekliliğin bir sonucu olarak yüksek bir yüzey-hacim oranı içerir; geniş bir ağ yüzey alanı, nöral doku mühendisliğinde atıkların ve besinlerin büyümesi ve taşınması için idealdir. Nöral doku mühendisliği için avantajlı olan elektrospun yapı iskelelerinin iki özelliği, ECM'yi yakından taklit eden morfoloji ve mimari ve besin alışverişine izin veren ancak glial skar dokusunun büyümesini önleyen doğru boyut aralığı olan gözeneklerdir. 10 um). Rastgele elektrospun PLLA yapı iskelelerinin, artan yüzey pürüzlülüğünden kaynaklanabilecek hücre yapışmasının arttığı gösterilmiştir. Kimyasal olarak modifiye edilmiş elektrospun fiber matların da nöral kök hücre farklılaşmasını etkilediği ve hücre proliferasyonunu arttırdığı gösterilmiştir. Son on yılda, bilim adamları ayrıca hücrelere ek topografik ipuçları sağlamaya hizmet eden hizalanmış nanofiber yapı iskelelerinin üretimi için çok sayıda yöntem geliştirdiler. Bu avantajlıdır çünkü büyük ölçekli üç boyutlu hizalanmış iskeleler geleneksel imalat teknikleri kullanılarak kolayca oluşturulamamaktadır. Yang ve ark. (2005), hizalanmış ve rastgele elektrospun poli (L-laktik asit) (PLLA) mikro lifli ve nano lifli yapı iskeleleri oluşturulmuş, karakterize edilmiş ve karşılaştırılmıştır. Elyaf çapları, elektro-eğirme için kullanılan başlangıç ​​polimer konsantrasyonu ile doğru orantılıydı; hizalanmış liflerin ortalama çapı, aynı işleme koşulları altında rastgele liflerinkinden daha küçüktü. Nöral kök hücrelerin, hizalanmış elektrospun liflerine paralel olarak uzadığı gösterildi. Hizalanmış nano lifler, hizalanmış mikro liflere, rastgele mikro liflere ve rastgele nano liflere kıyasla daha uzun bir ortalama nörit uzunluğuna sahipti. Ek olarak, hizalanmış nano liflerde, hizalanmış mikro liflerden daha fazla hücre farklılaştı. Bu nedenle, bu çalışmanın sonuçları, hizalanmış nano liflerin, sinir yenilenmesini teşvik etmek için hizalanmamış liflerden veya mikro liflerden daha faydalı olabileceğini göstermiştir.

Mikro yapı ve nano yapı

Üst yapı ile birlikte mikro yapı ve nano yapı, iskele topografyası oluşturulurken dikkate alınması gereken üç ana iskele yapısı seviyesidir. Üst yapı, iskelenin genel şeklini ifade ederken, mikro yapı, yüzeyin hücresel düzeydeki yapısını ve nano yapı, yüzeyin alt hücre düzeyindeki yapısını ifade eder. Her üç yapı seviyesi de hücre tepkilerini ortaya çıkarma yeteneğine sahiptir; bununla birlikte, hücre dışı matris içinde çok sayıda nano ölçekli yapının mevcudiyeti tarafından motive edilen nano ölçekli topografiye hücrelerin tepkisine önemli bir ilgi vardır. Kontrollü boyut, şekil ve kimya ile çeşitli topografyaların yaratılmasına izin veren mikro ve nano yapıların (çoğu yarı iletken endüstrisinden kaynaklanan) üretimi için giderek artan sayıda yöntem vardır.

Fiziksel ipuçları

Fiziksel ipuçları, mikro yapı ve/veya nano yapı düzeyinde düzenli bir yüzey yapısı oluşturularak oluşturulur. Nano ölçekteki fiziksel ipuçlarının hücre yapışmasını, göçünü, yönelimini, temas inhibisyonunu, gen ekspresyonunu ve hücre iskeleti oluşumunu modüle ettiği gösterilmiştir. Bu, çoğalma, farklılaşma ve yayılma gibi hücre süreçlerinin yönüne izin verir. Mikro ve nano ölçekli topografyaların üretimi için, düzenli topografyalar oluşturanlar ve sırasız topografyalar oluşturanlara bölünebilecek sayısız yöntem vardır.

Düzenli topografyalar , düzenli ve geometrik olarak kesin olan desenler olarak tanımlanır. Düzenli topografyalar oluşturmak için birçok yöntem olmasına rağmen, bunlar genellikle zaman alıcıdır, beceri, deneyim ve pahalı ekipman kullanımını gerektirir.

Fotolitografi , bir ışık kaynağının bir fotorezist kaplı silikon levhaya maruz bırakılmasını içerir; ışık kaynağı ile gofret arasına istenen desene sahip bir maske yerleştirilir, böylece ışığın seçici olarak filtrelenmesine ve fotorezist üzerinde desen oluşturmasına izin verilir. Gofretin daha da geliştirilmesi, fotorezistteki deseni ortaya çıkarır. Yakın UV'de gerçekleştirilen fotolitografi, genellikle mikro ölçekte topografilerin üretilmesi için standart olarak görülür. Ancak, boyut için alt sınır dalga boyunun bir fonksiyonu olduğundan, bu yöntem nano ölçekli özellikler oluşturmak için kullanılamaz. 2005 yılında yaptıkları çalışmada Mahoney ve ark. oluşturulan organize poliimid kanaldizileri(11 µm yüksekliğinde ve 20-60 µm genişliğinde) fotolitografi ile bir cam substrat üzerinde oluşturulmuştur. Cama iyi yapıştığı, sulu çözeltide kimyasal olarak kararlı olduğu ve biyouyumlu olduğu için poliimid kullanılmıştır. Mikro kanalların, nörit büyüme konilerindeki hücre iskeleti elemanlarının biriktirebileceği, birleştirebileceği ve yönlendirebileceği açı aralığını sınırladığı varsayılmaktadır. Somadan çıkan nörit sayısında önemli bir azalma oldu; ancak nöritlerin ortaya çıktığı açı aralığı arttıkça daha az azalma oldu. Ayrıca, nöronlar mikrokanallarda kültürlendiğinde, nöritler, düz bir yüzey üzerindeki kontrollere kıyasla ortalama olarak iki kat daha uzundu; bunun nedeni, filamentlerin daha verimli bir şekilde hizalanması olabilir.

Olarak elektron ışını litografi (EBL), bir elektron-duyarlı, yüksek enerjili bir elektron ışınına maruz karşı. Pozitif veya negatif tip direnç seçeneği vardır; ancak, negatif dirençlerle daha düşük özellik çözünürlüğü elde edilebilir. Malzemenin yüzeyi boyunca izlenecek kesin yol için elektron demeti programlanarak desenler oluşturulur. Çözünürlük, dirençte elektron saçılması ve alt tabakadan geri saçılma gibi diğer faktörlerden etkilenir. EBL, 3-5 nm düzeyinde tek yüzey özellikleri oluşturabilir. Doku mühendisliğinde olduğu gibi, geniş bir yüzey alanı üzerinde birden fazla özellik gerekiyorsa, çözünürlük düşer ve özellikler yalnızca 30-40 nm kadar küçük oluşturulabilir ve direnç gelişimi, desen oluşumu üzerinde daha fazla ağırlık oluşturmaya başlar. Direncin çözülmesini önlemek için moleküller arası kuvvetlerin üstesinden gelmek için ultrasonik ajitasyon kullanılabilir. Ayrıca izopropil alkol (IPA), yüksek yoğunluklu dizilerin geliştirilmesine yardımcı olur. EBL, polimerik malzemelerde nanometre modellerini kopyalayarak daha hızlı ve daha az maliyetli bir süreç haline gelebilir; replikasyon işlemi, sıcak kabartma ve solvent döküm kullanılarak polikaprolakton (PCL) ile gösterilmiştir . Gomez ve ark. (2007), EBL tarafından PDMS üzerinde oluşturulan 1 ve 2 µm genişliğinde ve 400 ve 800 nm derinliğindeki mikrokanalların, kültürde hipokampal hücrelerin akson oluşumunu hareketsizleştirilmiş kimyasal ipuçlarından daha fazla arttırdığı gösterilmiştir.

X-ışını litografisi , topografinin nöritojenezi teşvik etmedeki rolünü araştırmak için kullanılabilecek düzenli desenler oluşturmak için başka bir yöntemdir. Maske parametreleri, desenin periyodikliğini belirler, ancak sırt genişliği ve derinliği, aşındırma koşulları tarafından belirlenir. Bir çalışmada, 400 ile 4000 nm arasında değişen periyotlar, 70 ile 1900 nm arasında değişen genişlikler ve 600 nm oluk derinliği ile sırtlar oluşturulmuştur; gelişmekte olan nöritler, 70 nm kadar küçük özelliklerle temas rehberliği gösterdi ve nöritlerin %90'ından fazlası, sırtlar ve oluklar ile 10 derecelik paralel hizalama içindeydi. Kullanılan özellik boyutlarına göre oryantasyonda önemli bir fark yoktu. Hücre başına nörit sayısı, dallanma fenotiplerinden ziyade bipolar üreten sırtlar ve oluklar tarafından sınırlandırıldı.

Düzensiz topografyalar genellikle diğer işlemler sırasında kendiliğinden meydana gelen işlemler tarafından oluşturulur; desenler, özellik geometrisi üzerinde kesin olmayan veya hiç kontrol olmaksızın oryantasyon ve organizasyon açısından rastgeledir. Düzensiz topografyalar oluşturmanın avantajı, süreçlerin genellikle daha az zaman alması, daha az pahalı olması ve büyük beceri ve deneyim gerektirmemesidir. Sırasız topografiler, polimer karıştırma, kolloidal litografi ve kimyasal aşındırma ile oluşturulabilir.

Olarak , polimer karışımının bozulmasına , polimer karışımları kendiliğinden faz ayrılması deneyim; genellikle silikon gofretler üzerine spin döküm gibi koşullar sırasında ortaya çıkar. Bu yöntemle yaratılabilen özellikler, sırasıyla özellik şeklini ve boyutunu değiştirmek için polimer oranı ve konsantrasyonu ayarlanarak bir dereceye kadar kontrol edilebilen nano ölçekli çukurlar, adalar ve şeritleri içerir . Özelliklerin dikey yönü tam olarak kontrol edilebilmesine rağmen, yatay yönde çok fazla kontrol yoktur. Desen yatay olarak çok düzensiz olduğundan, bu yöntem yalnızca belirli yükseklik nanotopografileri ile hücre etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir .

Kolloidal litografi ucuzdur ve kontrollü yükseklik ve çaplara sahip yüzeyler oluşturmak için kullanılabilir. Nanokolliodlar, malzeme yüzeyi boyunca yayılarak bir aşındırma maskesi olarak kullanılır ve ardından sırasıyla nanokolliodlar ve nanopitler oluşturarak, nanokolliodların çevresini aşındırmak için iyon ışını bombardımanı veya film buharlaştırması kullanılır. Nihai yüzey yapısı, kolloidlerin kapladığı alan ve kolloid boyutu değiştirilerek kontrol edilebilir. Kolloidlerin kapladığı alan, kolloid çözeltisinin iyonik gücü değiştirilerek değiştirilebilir. Bu teknik, doku mühendisliği uygulamaları için gerekli olan geniş desenli yüzey alanları oluşturabilmektedir.

Kimyasal aşındırma , malzeme yüzeyinin, nanometre ölçeğinde çukurlar ve çıkıntılar tarafından oluşturulan istenen bir pürüzlülüğe aşındırılıncaya kadar hidroflorik asit (HF) veya sodyum hidroksit (NaOH) gibi bir aşındırıcı içinde ıslatılmasını içerir. Daha uzun aşındırma süreleri daha pürüzlü yüzeylere (yani daha küçük yüzey çukurları ve çıkıntılar) yol açar. Spesifik geometriye veya organizasyona sahip yapılar bu ilkel yöntemle oluşturulamaz, çünkü en iyi ihtimalle yüzey pürüzlülüğünü değiştirmek için bir yüzey işlemi olarak kabul edilebilir. Bu yöntemin önemli avantajları, kullanım kolaylığı ve nanotopografilerle bir yüzey oluşturmak için düşük maliyettir. Silikon gofretler HF kullanılarak aşındırıldı ve hücre yapışmasının yalnızca belirli bir pürüzlülük aralığında (20-50 nm) arttırıldığı gösterildi.

kimyasal ipuçları

Fiziksel ipuçlarıyla topografi oluşturmaya ek olarak, bir substratın yüzeyinde desenler halinde polimer çözeltisini seçici olarak biriktirerek kimyasal ipuçlarıyla oluşturulabilir. Kimyasal ipuçlarını depolamak için farklı yöntemler vardır. Kimyasal çözeltileri dağıtmak için iki yöntem, şerit desenleme ve piezoelektrik mikro dağıtmayı içerir.

Seyreltilmiş polimer çözeltisi dökülerek katı substratlar üzerinde şerit desenli polimer filmler oluşturulabilir. Bu yöntem nispeten kolay, ucuzdur ve kullanılabilecek iskele malzemeleri üzerinde herhangi bir kısıtlamaya sahip değildir. Prosedür, bir polimer çözeltisi ile doldurulmuş dar bir boşlukla dikey olarak ayrılmış halde tutulurken yatay olarak üst üste binen cam plakaları içerir. Üst plaka, 60 ve 100 µm/s arasında sabit bir hızla hareket ettirilir. Çözücünün buharlaşmasını takiben kayan camın kenarında sürekli olarak ince bir sıvı çözelti filmi oluşur. 60, 70 ve 100 µm/s hızlarda hazırlanan şerit desenleri sırasıyla 2,2 ve 6,1 µm, 3,6 ve 8,4 µm ve 4,3 ve 12.7 µm genişlik ve oluk aralıkları oluşturdu; sırtlar için yükseklik aralığı 50-100 nm idi. Tsuruma, Tanaka ve ark. embriyonik nöral hücrelerin, poli-L-lisin ile eklenmiş ve poli(ε-kaprolakton)/kloroform solüsyonu (1g/L) şeritlerine paralel uzatılmış, dar desen genişliği ve aralığı (genişlik: 2,2 µm, aralık: 6.1) ile kaplanmış film üzerinde kültürlendiğini göstermiştir. um). Ancak nöronlar, geniş genişlik ve aralıkla (genişlik: 4,3 µm, aralık: 12,7 µm) desenlerin ekseni boyunca büyüdü. Ortalama olarak, şerit desenli filmlerdeki nöronlar, desensiz filmlerdeki nöronlara kıyasla hücre başına daha az nörite ve daha uzun nöritlere sahipti. Böylece, şerit modeli parametreleri büyüme yönünü, nöritlerin uzunluğunu ve hücre başına nörit sayısını belirleyebilir.

Microdispensing yapışkan laminin ve yapışkan olmayan damlacıklarını dağıtma polistiren kültür çanakları üzerinde micropatterns oluşturmak için kullanılan , sığır serum albümini (BSA) çözeltiler. Mikro dağıtıcı, her iki ucunda bir giriş ve ortada bir nozül bulunan, silikonla oyulmuş bir kanalın üstündeki bir itme çubuğuna bağlı bir piezoelektrik elemandır. Piezoelektrik eleman, voltaj uygulandığında genleşerek sıvının memeden dağıtılmasına neden olur. Mikro dağıtıcı, bilgisayar kontrollü bir xy tablosu kullanılarak hareket ettirilir. Mikro model çözünürlüğü birçok faktöre bağlıdır: dağıtılan sıvı viskozitesi, damla aralığı (bir çizgi veya dizideki iki bitişik damlacığın merkezi arasındaki mesafe) ve alt tabaka. Artan viskozite ile çizgiler incelir, ancak sıvı viskozitesi çok yüksekse sıvı dışarı atılamaz. Çözeltinin ısıtılması daha düzgün protein hatları oluşturur. Sürekli çizgiler oluşturmak için bir miktar damlacık örtüşmesi gerekli olsa da, eşit olmayan buharlaşma çizgiler boyunca eşit olmayan protein konsantrasyonuna neden olabilir; bu, dağıtılan çözelti özelliklerini değiştirerek daha yumuşak buharlaşma yoluyla önlenebilir.

0.5 mg/ml laminin içeren desenler için, mikro-dağıtılmış çizgiler üzerinde çizgiler arasında olduğundan daha yüksek oranda nörit büyüdü. 10 mg/ml ve 1 mg/ml BSA protein modellerinde ve yağ asidi içermeyen BSA protein modellerinde önemli sayıda nörit, protein çizgilerinden kaçındı ve çizgiler arasında büyüdü. Bu nedenle, yağ asidi içeren BSA çizgileri, yağ asitleri ile BSA içeren çizgiler kadar nörit büyümesi için izin vermiyordu. Mikro dağıtım, substrat yüzeyleri ile doğrudan temas gerektirmediğinden, bu teknik, temas yoluyla yok edilebilecek hassas mikro veya nanotopolojiye sahip yüzeyleri kullanabilir. Daha fazla veya daha az damlacık dağıtarak biriken protein miktarını değiştirmek mümkündür. Mikro dağıtmanın bir avantajı, kalıpların 5-10 dakika içinde hızlı bir şekilde oluşturulabilmesidir. Piezoelektrik mikro dağıtıcı ısıtma gerektirmediğinden, ısıya duyarlı proteinler ve sıvıların yanı sıra canlı hücreler de dağıtılabilir.

İskele malzemesi

İskele malzemesi seçimi belki de verilecek en önemli karardır. Biyouyumlu ve biyolojik olarak parçalanabilir olmalıdır; ek olarak, arzu edilen herhangi bir fiziksel, kimyasal veya biyolojik ipucunu içerebilmelidir; bu, bazı kimyasal ipuçları durumunda, peptitleri ve diğer molekülleri kimyasal olarak bağlamak için uygun bir alana sahip olması gerektiği anlamına gelir. Sinir kılavuz kanalları için seçilen yapı iskelesi malzemeleri neredeyse her zaman hidrojellerdir. Hidrojel, biyolojik veya sentetik polimerlerden oluşabilir. Hem biyolojik hem de sentetik polimerlerin güçlü ve zayıf yönleri vardır. (1) degradasyon ve rezorpsiyon hızları doku oluşum hızıyla eşleşmediğinde, (2) stres-gerilme özellikleri nöral dokununkilerle iyi bir şekilde karşılaştırılmadığında, (3) kanal malzemesinin yetersiz iyileşmeye neden olabileceğini belirtmek önemlidir. önemli deformasyona neden olan bozunma şişmesi meydana geldiğinde, (4) büyük bir iltihaplanma tepkisi ortaya çıktığında veya (5) malzemenin düşük geçirgenliğe sahip olması.

hidrojel

Hidrojeller , kimyasal veya fiziksel olarak çapraz bağlı suda çözünür polimerler olan bir biyomalzeme sınıfıdır. Kimyaları tarafından belirlendiği gibi bozunabilir veya bozunamaz olabilirler, ancak mümkün olduğunda bozunabilir daha çok arzu edilir. Hidrojellere genellikle yüksek biyouyumluluk, yumuşak dokuya benzer mekanik özellikler ve jelleşen bir sıvı olarak enjekte edilebilmeleri nedeniyle doku mühendisliği amaçları için büyük ilgi vardır. Hidrojeller fiziksel olarak çapraz bağlı olduklarında jelleşme için faz ayrımına güvenmek zorundadırlar; faz ayrımı sıcaklığa bağlıdır ve tersine çevrilebilir. Hidrojellerin diğer bazı avantajları ise sadece toksik olmayan sulu çözücüler kullanmaları, besinlerin infüzyonuna ve atık ürünlerin çıkışına izin vermeleri ve hücrelerin kendiliğinden bir araya gelmesine izin vermeleridir. Hidrojellerin arayüzey gerilimi düşüktür, bu da hücrelerin doku-implant sınırı boyunca kolayca göç edebileceği anlamına gelir. Bununla birlikte, hidrojellerle, kontrollü gözenek boyutuna sahip çok çeşitli mekanik özellikler veya yapılar oluşturmak zordur.

sentetik polimer

Bir sentetik bir polimer parçalanamayan veya bozunabilir olabilir. Nöral doku mühendisliği amacıyla, mümkün olan her durumda bozunabilir malzemeler tercih edilir, çünkü iltihaplanma ve yara izi gibi uzun vadeli etkiler sinir fonksiyonuna ciddi şekilde zarar verebilir. Bozunma hızı, polimerin moleküler ağırlığına, kristalliğine ve glikolik asidin laktik asit alt birimlerine oranına bağlıdır. Bir metil grubu nedeniyle , laktik asit , hidrolizinin daha yavaş olmasına neden olan glikolik asitten daha hidrofobiktir . Sentetik polimerler, geniş bir aralıkta kontrol edilebilen daha güçlü mekanik özelliklere ve bozunma oranlarına sahiptir ve immünojenisite endişesini ortadan kaldırır. Şu anda nöral doku mühendisliğinde kullanılan birçok farklı sentetik polimer vardır. Bununla birlikte, bu polimerlerin birçoğunun dezavantajları, bu polimerlerin hücre bağlanmasını, çoğalmasını ve farklılaşmasını desteklemesini engelleyen biyouyumluluk ve biyoaktivite eksikliğini içerir. Sentetik kanallar sadece 1-2 cm'den küçük çok kısa sinir lezyon boşluklarının onarımı için klinik olarak başarılı olmuştur. Ayrıca, bu kanallarla sinir rejenerasyonu, sinir otogreftlerinde görülen fonksiyonel iyileşme düzeyine henüz ulaşmamıştır.

kollajen-terpolimer

Kollajen , hücre dışı matrisin önemli bir bileşenidir ve periferik sinirlerin destekleyici dokularında bulunur. Üç monomerinin serbest radikal kopolimerizasyonu ile bir terpolimer (TERP) sentezlendi ve kollajen ile çapraz bağlanarak hibrit bir biyolojik-sentetik hidrojel iskelesi oluşturuldu. Terpolimer, hücre dostu bir polimer olduğu bilinen poli(NIPAAM) bazlıdır. TERP, hem hidrojel sağlamlığını artırmak için bir çapraz bağlayıcı olarak hem de akriloksisüksinimit gruplarının bazılarını peptitler veya büyüme faktörleri üzerindeki –NH2 gruplarıyla reaksiyona sokarak biyoaktif peptitlerin veya büyüme faktörlerinin aşılanması için bir alan olarak kullanılır. Kollajen-terpolimer (kollajen-TERP) hidrojeli, biyoaktif bir bileşenden yoksun olduğundan, hücre yapışma özelliklerini geliştirmek için laminin (YIGSR) içinde bulunan ortak bir hücre yapışma peptitine eklenmiş bir çalışma .

Poli (laktik-ko-glikolik asit) ailesi

PLGA ailesindeki polimerler arasında poli (laktik asit) (PLA), poli (glikolik asit) (PGA) ve bunların kopolimeri poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) bulunur. Üç polimerin tümü, çeşitli cihazlarda kullanılmak üzere Gıda ve İlaç İdaresi tarafından onaylanmıştır. Bu polimerler kırılgandır ve izin verilen kimyasal modifikasyon için bölgeleri yoktur; ek olarak, pürüzsüz ve ideal bir bozunma süreci olmayan yüzeyden ziyade toplu olarak bozunurlar. İşlevsellik eksikliğinin üstesinden gelmek için, yapılarına serbest aminler dahil edilmiştir; bu peptidlerden hücre bağlanmasını ve davranışını kontrol etmek için bağlanabilmektedir.

Aminoetil metakrilat (AEMA) ile kopolimerize edilmiş metakrilatlı dekstran (Dex-MA)

Dekstran , bakterilerden türetilen bir polisakkarittir; genellikle leuconostoc veya Streptococcus'un belirli suşlarından enzimler tarafından üretilir . α-1,6-bağlı D-glukopiranoz kalıntılarından oluşur. Çapraz bağlı dekstran hidrojel boncukları, kolon kromatografisi uygulamaları ve mikro taşıyıcı hücre kültürü teknolojisi için düşük protein bağlayıcı matrisler olarak yaygın şekilde kullanılmaktadır . Bununla birlikte, dekstran hidrojellerinin biyomalzeme uygulamalarında ve özellikle ilaç dağıtım araçları olarak araştırıldığı yakın zamana kadar olmamıştır. Biyomalzeme uygulamalarında dekstran kullanmanın bir avantajı, protein adsorpsiyonuna ve hücre yapışmasına karşı direncini içerir; bu, ECM bileşenlerinden kasıtlı olarak eklenen peptitler tarafından spesifik hücre yapışmasının belirlenmesine izin verir. AEMA, hücre yapışmasını teşvik etmek üzere ECM'den türetilen peptitlerin bağlanması için bir alan sağlamak üzere birincil amin gruplarını tanıtmak amacıyla Dex-MA ile kopolimerize edildi. Peptitler, sülfo-SMMC birleştirme kimyası ve sistein ile sonlandırılmış peptitler kullanılarak hareketsiz hale getirilebilir. Dex-MA'nın AEMA ile kopolimerizasyonu, hücresel etkileşimleri desteklemenin yanı sıra yapı iskelelerinin makro gözenekli geometrisinin korunmasına izin verdi.

Poli(gliserol sebakat) (PGS)

Bir sinir yönlendirme kanalının oluşturulmasında kullanılmak üzere poli(gliserol sebakat)'tan (PGS) yeni biyolojik olarak parçalanabilen, sert bir elastomer geliştirilmiştir. PGS orijinal olarak yumuşak doku mühendisliği amaçlarıyla özellikle ECM mekanik özelliklerini taklit etmek için geliştirilmiştir. Bir elastomer olarak kabul edilir, çünkü mekanik olarak dinamik ortamlarda deformasyondan kurtulabilir ve mikro gerilimler şeklinde yenilenen dokular boyunca stresi etkin bir şekilde dağıtabilir. PGS, eritilerek işlenebilen veya istenen şekle solvent ile işlenebilen gliserol ve sebasik asidin bir polikondensasyon reaksiyonu ile sentezlenir. PGS, 0,28 MPa'lık bir Young modülüne ve 0,5 MPa'dan büyük bir nihai gerilme mukavemetine sahiptir. Periferik sinir, PGS'ninkine çok yakın olan yaklaşık 0.45 MPa'lık bir Young modülüne sahiptir. Ek olarak, PGS, rezorpsiyon sırasında lineer kütle ve kuvvette kayıplarla birlikte yüzey bozulması yaşar. İmplantasyonu takiben, bozunma yarı ömrü 21 gün olarak belirlendi; 60. günde tam bozunma meydana geldi. PGS, bozunma sırasında minimum su emilimi yaşar ve saptanabilir şişmeye sahip değildir; şişme, tübüler lümeni daraltan ve rejenerasyonu engelleyebilen distorsiyona neden olabilir. PGS'nin bozunma süresinin çapraz bağlanma derecesinin ve sebasik asidin gliserole oranının değiştirilmesiyle değiştirilebilmesi avantajlıdır. Sundback ve ark. (2005), implante edilmiş PGS ve PLGA kanalları benzer erken doku tepkilerine sahipti; bununla birlikte, PLGA inflamatuar yanıtları daha sonra yükselirken, PGS inflamatuar yanıtları azalmaya devam etti.

Polietilen glikol hidrojel

Polietilen glikol (PEG) hidrojelleri biyolojik olarak uyumludur ve CNS dahil birçok doku tipinde tolere edildiği kanıtlanmıştır. Mahoney ve Anseth, parçalanabilir PEG makromerlerine kovalent olarak bağlı metakrilat gruplarını fotopolimerize ederek PEG hidrojellerini oluşturdu. Hidrojel bozunması, şişme oranı verilerinden mekanik mukavemet (basınç modülü) ve ortalama ağ boyutu ölçülerek zaman içinde izlendi. Başlangıçta, polimer zincirleri yüksek oranda çapraz bağlıydı, ancak bozunma ilerledikçe ester bağları hidrolize edilerek jelin şişmesine izin verildi; hidrojel tamamen eriyene kadar ağ boyutu arttıkça sıkıştırma modülü azaldı. Nöral öncü hücrelerin, minimum hücre ölümü ile PEG jelleri üzerinde fotokapsüllenebildiği ve kültürlenebildiği gösterilmiştir. Ağ boyutu başlangıçta küçük olduğundan, hidrojel çevre dokudan gelen inflamatuar ve diğer inhibitör sinyalleri bloke eder. Ağ boyutu arttıkça, hidrojel akson rejenerasyonu için bir iskele görevi görebilir.

biyolojik polimerler

Biyolojik polimerleri sentetik polimerlere göre kullanmanın avantajları vardır. İyi bir biyouyumluluğa sahip olmaları ve kolayca parçalanmaları çok olasıdır, çünkü zaten doğada bir şekilde mevcutturlar. Bununla birlikte, birkaç dezavantaj da vardır. Geniş bir aralıkta kontrol edilemeyen hantal mekanik özelliklere ve bozulma oranlarına sahiptirler. Ek olarak, doğal olarak elde edilen materyallerin bir bağışıklık tepkisine neden olma veya mikrop içerme olasılığı her zaman vardır. Doğal olarak türetilen malzemelerin üretiminde, büyük ölçekli izolasyon prosedürlerinde kontrol edilemeyen partiden partiye farklılıklar da olacaktır. Doğal polimerleri rahatsız eden diğer bazı problemler, çökme, skar oluşumu ve erken yeniden emilim olasılığı nedeniyle uzun lezyon boşlukları boyunca büyümeyi destekleyememeleridir. Bazılarının üstesinden gelinebilecek tüm bu dezavantajlara rağmen, biyolojik polimerler birçok durumda hala en uygun seçim olduğunu kanıtlamaktadır.

Polisialik asit (PSA)

Polisialik asit (PSA), yapay sinir kanalları için nispeten yeni, biyolojik olarak uyumlu ve biyolojik olarak emilebilir bir malzemedir. a2,8-bağlı sialik asit kalıntılarının bir homopolimeri ve nöral hücre adezyon molekülünün (NCAM) dinamik olarak düzenlenmiş bir translasyon sonrası modifikasyonudur. Son çalışmalar, polisialillenmiş NCAM'nin (polySia-NCAM) motor sisteminde rejenerasyonu desteklediğini göstermiştir. PSA, hücre kültürü koşulları altında stabilite gösterir ve enzimler tarafından indüklenen bozunmaya izin verir. Ayrıca yakın zamanda PSA'nın nöritojenez, aksonal yol bulma ve nöroblast göçü gibi yönlendirme süreçlerinde yer aldığı keşfedilmiştir. Genetik olarak nakavt edilmiş PSA'lı hayvanlar, başarısız yol bulma özelliğine sahip ölümcül bir fenotip ifade eder; iki beyin yarım küresini birbirine bağlayan sinirler anormal veya eksikti. Bu nedenle PSA, uygun sinir sistemi gelişimi için hayati öneme sahiptir.

Kollajen Tip I/III

Kollajen , hücre dışı matrisin ana bileşenidir ve sinir rejenerasyonu ve onarımında yaygın olarak kullanılmaktadır. Pürüzsüz mikrogeometrisi ve geçirgenliği nedeniyle, kolajen jeller, moleküllerin içlerinden difüzyonuna izin verebilir. Kollajen emilim oranları, kolajenin polipoksi bileşikleri ile çapraz bağlanmasıyla kontrol edilebilir. Ek olarak, kolajen tip I/III yapı iskeleleri iyi bir biyouyumluluk göstermiştir ve Schwann hücre proliferasyonunu destekleyebilmektedir. Bununla birlikte, sıçanlarda sinir boşluklarını kapatmak için kullanılan Schwann hücreleri ile doldurulmuş kolajen kanalları, sinir otogreftlerine kıyasla şaşırtıcı derecede başarısız sinir rejenerasyonu göstermiştir. Bunun nedeni, başarılı sinir rejenerasyonu için gerekli olan tek faktörün biyouyumluluk olmamasıdır; iç çap, iç mikrotopografi, gözeneklilik, duvar kalınlığı ve Schwann hücre tohumlama yoğunluğu gibi diğer parametrelerin, bu kolajen I/III jellerinden elde edilen sonuçları iyileştirmek için gelecekteki çalışmalarda incelenmesi gerekecektir.

Örümcek ipek lifi

Örümcek ipeği liflerinin hücresel yapışmayı, çoğalmayı ve canlılığı desteklediği gösterilmiştir. Allmeling, Jokuszies ve ark. Schwann hücrelerinin iki kutuplu bir şekilde büyüyerek ipek liflerine hızlı ve sıkı bir şekilde bağlandığını gösterdi; ipek liflerinde proliferasyon ve hayatta kalma oranları normaldi.

Schwann hücreleri ve hücresizleştirilmiş ksenojenik damarlarla bir sinir kanalı oluşturmak için örümcek ipeği liflerini kullandılar. Schwann hücreleri, kısa bir süre içinde ipek lifleri boyunca kolonlar oluşturdu ve kolonlar, PNS yaralanmasından sonra in vivo büyüyen Bungner bantlarına benziyordu . Örümcek ipeği, örümceklerin yırtıcı doğası ve bireysel örümceklerden düşük ipek verimi nedeniyle doku mühendisliğinde şimdiye kadar kullanılmamıştır. Nephila clavipes türünün ipekböceği ipeğinden daha az immünojenik olan ipek ürettiği keşfedilmiştir; 4 x 109 N/m çekme mukavemetine sahiptir, bu da çeliğin kırılma mukavemetinin altı katıdır. Örümcek ipeği proteolitik olarak bozunduğu için, bozunma sırasında pH'ta fizyolojik pH'dan bir kayma olmaz. Örümcek ipeğinin diğer avantajları arasında mantar ve bakteriyel ayrışmaya haftalarca direnç göstermesi ve şişmemesi yer alır. Ayrıca ipeğin yapısı hücre yapışmasını ve göçünü destekler. Bununla birlikte, ipek hasadı hala sıkıcı bir iştir ve kesin kompozisyon, diyet ve çevreye bağlı olarak türler arasında ve hatta aynı türün bireyleri arasında değişir. Örümcek ipeğini sentetik olarak üretme girişimleri olmuştur. Bir örümcek ipek sinir kanalının in vitro ve in vivo kullanımının fizibilitesini test etmek için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır .

ipekböceği ipek fibroini

Örümceklere ek olarak, ipekböcekleri de başka bir ipek kaynağıdır. Bombyx mori ipekböceklerinden elde edilen protein, tutkal benzeri proteinlerin bir ailesi olan serisin ile çevrili bir fibroin proteini çekirdeğidir . Fibroin, tekrarlanan hidrofobik ve kristalize edilebilir bir diziye sahip bir ağır zincir olarak karakterize edilmiştir: Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-X (X, Ser veya Tyr anlamına gelir). Çevreleyen serisin, birçok polar kalıntı nedeniyle daha hidrofiliktir, ancak yine de bazı hidrofobik β-tabaka kısımlarına sahiptir. İpekler, yüksek mekanik mukavemetleri ve esnekliklerinin yanı sıra su ve oksijen geçirgenlikleri nedeniyle uzun süredir sütür olarak kullanılmaktadır. Ayrıca ipek fibroin kolayca manipüle edilebilir ve sterilize edilebilir. Ancak istenmeyen immünolojik reaksiyonlar bildirildiğinde ipek kullanımı durdurulmuştur. Son zamanlarda, immünolojik sorunların nedeninin yalnızca çevredeki serisinden kaynaklandığı keşfedildi. Bu keşiften bu yana, serisin çıkarılmış ipek birçok farmasötik ve biyomedikal uygulamada kullanılmıştır. İpek kullanılmadan önce serisini fibroinin çevresinden çıkarmak gerektiğinden, gam giderme olarak bilinen etkili bir prosedürün geliştirilmesi gerekir. Sulu Na kaynayan bir gam giderme yöntemi kullanımları 2 CO 3 fibroin zarar vermeden serisini kaldırır çözelti. Yang, Chen ve ark. ipek fibroin ve ipek fibroin özütü sıvısının, proliferasyon üzerinde hiçbir sitotoksik etkisi olmaksızın Schwann hücreleri ile iyi bir biyouyumluluk gösterdiğini göstermiştir.

kitosan

Kitosan ve kitin , β(1–4)-bağlı N-asetil-D-glukozamin ve D-glukozamin alt birimlerinden oluşan bir biyopolimer ailesine aittir. Kitosan, selülozdan sonra en bol bulunan ikinci doğal polimer olan kitinin alkali N-deasetilasyonu ile oluşturulur. Kitosan, şelatlama maddesi, ilaç taşıyıcı, membran ve su arıtma katkı maddesi gibi birçok biyomedikal uygulamada faydalı olan biyolojik olarak parçalanabilen bir polisakkarittir. Kitosan, seyreltik sulu çözeltilerde çözünür, ancak nötr pH'ta bir jele çöker. Nöral hücre bağlanmasını ve çoğalmasını iyi desteklemez, ancak ECM'den türetilen peptit eki ile geliştirilebilir. Kitosan ayrıca üstesinden gelinmesi daha zor olan zayıf mekanik özellikler içerir.

Çözünebilir kitosan için asetilasyon derecesi (DA), işleme koşullarına bağlı olarak %0 ila %60 arasında değişir. Değişen DA'nın kitosan özelliklerini nasıl etkilediğini karakterize etmek için bir çalışma yapılmıştır. Değişken DA, asetik anhidrit veya alkalin hidroliz kullanılarak elde edildi . Asetilasyonun azalmasının basınç dayanımında bir artış yarattığı bulundu. Biyobozunma, esas olarak kitosanın glikosidik bağlarını hidrolize ederek in vivo parçalanmasından sorumlu olduğu bilinen ve sinir hasarından sonra fagositik hücreler tarafından salınan lizozim kullanılarak incelenmiştir . Sonuçlar, çalışılan zaman periyodu boyunca yüksek ve düşük DA'lar ile karşılaştırıldığında, ara DA'lar ile hızlandırılmış bir kütle kaybı olduğunu ortaya koymaktadır. DRG hücreleri N-asetillenmiş kitosan üzerinde büyütüldüğünde, artan DA ile hücre canlılığı azaldı. Ayrıca kitosan, daha fazla hücre yapışmasından sorumlu olan azalan DA ile artan bir yük yoğunluğuna sahiptir. Bu nedenle, kitosan'ın DA'sının kontrol edilmesi, bozunma süresinin düzenlenmesi için önemlidir. Bu bilgi, chitosan'dan bir sinir kılavuz kanalının geliştirilmesine yardımcı olabilir.

Aragonit

Aragonit yapı iskelelerinin son zamanlarda sıçan hipokampüsünden nöronların büyümesini desteklediği gösterilmiştir. Shany et al. (2006), aragonit matrislerinin astrositik ağların büyümesini in vitro ve in vivo destekleyebileceğini kanıtladı . Bu nedenle, aragonit yapı iskeleleri sinir dokusu onarımı ve rejenerasyonu için faydalı olabilir. Aragonitten türetilen Ca2 +' nın hücre yapışmasını ve hücre-hücre temasını desteklemek için gerekli olduğu varsayılmaktadır . Bu muhtemelen cadherinler gibi Ca2 + bağımlı adezyon moleküllerinin yardımıyla gerçekleştirilir . Aragonit kristal matrislerinin hidrojellere göre birçok avantajı vardır. Daha iyi hücre büyümesine izin veren daha büyük gözeneklere sahiptirler ve malzeme, hücre yapışmasını ve hayatta kalmasını destekleyen Ca2 + salınımının bir sonucu olarak biyoaktiftir . Ek olarak, aragonit matrislerinin hidrojellerden daha yüksek mekanik mukavemeti vardır, bu da onların yaralı bir dokuya bastırıldığında daha fazla basınca dayanmalarını sağlar.

aljinat

Aljinat, kolayca zincir oluşturan bir polisakkarittir; mekanik olarak daha kararlı bir hidrojel oluşturmak için Cu2 + , Ca2 + veya Al 3+ gibi çok değerlikli katyonlarla karboksilik gruplarında çapraz bağlanabilir . Kalsiyum aljinatlar, hem biyouyumlu hem de immünojenik olmayan ve doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmış olan polimerler oluşturur. Ancak, proksimal ucun hedefiyle yeniden bağlanması için gerekli olan boylamsal yönelimli büyümeyi destekleyemezler. Bu sorunun üstesinden gelmek için anizotropik kapiler hidrojeller (ACH) geliştirilmiştir. Katmanlar halinde çok değerlikli katyonların sulu çözeltileri ile sodyum aljinatın sulu çözeltilerinin üst üste bindirilmesiyle oluşturulurlar. Oluşumdan sonra, elektrolit iyonları polimer çözelti katmanlarına yayılır ve enerji tüketen bir konvektif süreç iyonların çökelmesine neden olarak kılcal damarlar oluşturur. Dağıtıcı konvektif süreç, polielektrolit zincirleri arasında difüzyon gradyanlarının ve sürtünmenin muhalefetiyle sonuçlanır. Kılcal duvarlar, çökeltilmiş metal aljinat ile kaplanırken, lümen ekstrüde su ile doldurulur.

Prang et al. (2006), yaralı memeli CNS'de yönlendirilmiş aksonal yeniden büyümeyi desteklemek için ACH jellerinin kapasitesini değerlendirdi. Aljinat bazlı ACH jellerini oluşturmak için kullanılan çok değerlikli iyonlar, sodyum aljinat katmanlarına difüzyonu altıgen yapılı anizotropik kılcal jeller oluşturan bakır iyonlarıydı. Çökeltmeden sonra, tüm jel, uzunlamasına yönlendirilmiş kılcal damarlardan geçildi. ACH iskeleleri, yetişkin NPC'nin hayatta kalmasını ve yüksek oranda yönlendirilmiş akson rejenerasyonunu destekledi. Bu, anizotropik yapılı kapiler jeller üretmek için aljinatların kullanılmasının ilk örneğidir. Gelecekteki çalışmaların ACH iskelelerinin uzun vadeli fiziksel stabilitesini incelemesi gerekiyor, çünkü CNS akson rejenerasyonu aylar sürebilir; ancak iskelelerin uzun süreli destek sağlayabilmesinin yanı sıra parçalanabilir olması da gerekir. Prang ve diğerleri tarafından araştırılan tüm biyolojik ve sentetik biyopolimerlerden. (2006), sadece agaroz bazlı jeller, ACH yapı iskelelerinin neden olduğu lineer rejenerasyon ile karşılaştırabildi. Gelecekteki çalışmaların ayrıca ACH iskelelerinin bir omurilik yaralanmasından sonra hedefin in vivo olarak yeniden canlandırılmasına izin verip vermediğini araştırması gerekecektir .

Hyaluronik asit hidrojel

Hyaluronik asit (HA), mükemmel biyouyumluluğu ve fizyolojik fonksiyon çeşitliliği nedeniyle yaygın olarak kullanılan bir biyomateryaldir. Özel HA-protein etkileşimleri yoluyla büyük glikozaminoglikanları (GAG'ler) ve proteoglikanları bağladığı hücre dışı matriste (ECM) bol miktarda bulunur. HA ayrıca, hücre yapışmasını ve hareketliliğini düzenleyen ve çoğalma ve farklılaşmayı destekleyen hücre içi sinyal kaskadlarının aktivasyonu ile sonuçlanan CD44 gibi hücre yüzeyi reseptörlerine de bağlanır. HA'nın ayrıca anjiyogenezi desteklediği de bilinmektedir, çünkü onun bozunma ürünleri endotelyal hücre proliferasyonunu ve göçünü uyarmaktadır. Bu nedenle HA, dokuların hayatta kalması için gerekli olan normal süreçlerin sürdürülmesinde çok önemli bir rol oynar. Modifiye edilmemiş HA, oküler cerrahi, yara iyileşmesi ve plastik cerrahi gibi klinik uygulamalarda kullanılmıştır. HA, hidrojeller oluşturmak için çapraz bağlanabilir. Modifiye edilmemiş veya laminin ile modifiye edilmiş HA hidrojelleri, yetişkin bir merkezi sinir sistemi lezyonuna implante edildi ve Hou ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada nöral doku oluşumunu indükleme yetenekleri açısından test edildi. glial skar oluşumunu engellemeye ek olarak. Ayrıca, laminin ile modifiye edilmiş HA hidrojelleri, nörit uzamasını destekleyebildi. Bu sonuçlar, HA jellerini bir sinir yönlendirme kanalı için umut verici bir biyomateryal olarak desteklemektedir.

Hücresel tedaviler

İskele malzemesine ve fiziksel ipuçlarına ek olarak, biyolojik ipuçları da hücre şeklinde bir biyoyapay sinir kanalına dahil edilebilir. Sinir sisteminde, nöronların büyümesini ve bakımını desteklemeye yardımcı olan birçok farklı hücre tipi vardır. Bu hücreler topluca glial hücreler olarak adlandırılır. Glial hücreler, akson rejenerasyonunu teşvik etme yeteneklerinin ardındaki mekanizmaları anlamak amacıyla araştırılmıştır. Üç tip glial hücre tartışılmıştır: Schwann hücreleri, astrositler ve koku alma hücreleri. Gliyal hücrelere ek olarak, kök hücreler de onarım ve rejenerasyon için potansiyel faydaya sahiptir, çünkü birçoğu nöronlara veya glial hücrelere farklılaşabilir. Bu makale, yetişkin, transdiferansiye mezenkimal, ektomezenkimal, nöral ve nöral progenitör kök hücrelerin kullanımını kısaca tartışmaktadır.

Gliyal hücreler

Glial hücreler , periferik ve merkezi sinir sistemindeki nöronların büyümesini ve bakımını desteklemek için gereklidir. Çoğu glial hücre ya periferik ya da merkezi sinir sistemine özgüdür. Schwann hücreleri, nöronların aksonlarını miyelinleştirdikleri periferik sinir sisteminde bulunur. Astrositler merkezi sinir sistemine özgüdür; nöronlar için besin, fiziksel destek ve yalıtım sağlarlar. Ayrıca kan beyin bariyerini oluştururlar. Ancak koku alma hücreleri, CNS-PNS sınırını geçerler çünkü koku alma reseptör nöronlarını PNS'den CNS'ye yönlendirirler.

Schwann hücreleri

Schwann hücreleri (SC), periferik sinir rejenerasyonu için çok önemlidir; hem yapısal hem de işlevsel roller oynarlar. Schwann hücreleri hem Wallerian dejenerasyonunda hem de Bungner bantlarında yer almaktan sorumludur. Periferik bir sinir hasar gördüğünde, Schwann hücreleri morfolojilerini, davranışlarını ve çoğalmalarını değiştirerek Wallerian dejenerasyon ve Bungner bantlarına dahil olurlar. Wallerian dejenerasyonunda, Schwann hücreleri, endonöral tüp boyunca sıralı sütunlarda büyür ve endonöral kanalı koruyan ve koruyan bir Bungner (boB) bandı oluşturur. Ek olarak, makrofajlarla birlikte yeniden büyümeyi artıran nörotrofik faktörleri serbest bırakırlar. Nöral doku mühendisliğinde Schwann hücrelerinin kullanılmasının bazı dezavantajları vardır; örneğin, Schwann hücrelerini seçici olarak izole etmek zordur ve izole edildikten sonra zayıf proliferasyon gösterirler. Bu zorluğun üstesinden gelmenin bir yolu, kök hücreler gibi diğer hücreleri yapay olarak SC benzeri fenotiplere indüklemektir.

Eguchi et al. (2003), Schwann hücrelerini hizalamak için manyetik alanların kullanımını araştırmışlardır. Merkezinde 8 T alan üreten yatay tip bir süper iletken mıknatıs kullandılar. 60 saatlik maruz kalma içinde, Schwann hücreleri alana paralel olarak hizalandı; aynı aralıkta, Schwann hücreleri rastgele bir şekilde yönlendirilmiş olarak maruz kalmaz. Membran bileşenlerinin ve hücre iskeleti elemanlarının manyetik alan duyarlılığındaki farklılıkların manyetik yönelime neden olabileceği varsayılmaktadır. Kollajen lifleri de manyetik alana maruz bırakıldı ve 2 saat içinde manyetik alana dik olarak hizalanırken, kolajen lifleri manyetik alana maruz kalmadan rastgele bir ağ örgüsü modeli oluşturdu. Kollajen lifleri üzerinde kültürlendiğinde, Schwann hücreleri, iki saatlik 8-T manyetik alana maruz kaldıktan sonra manyetik olarak yönlendirilmiş kolajen boyunca hizalanır. Buna karşılık, Schwann hücreleri, manyetik alan maruziyeti olmaksızın kollajen liflerine rastgele yönlendirilir. Böylece, kolajen lifleri üzerinde kültür, Schwann hücrelerinin manyetik alana dik olarak yönlendirilmesine ve çok daha hızlı yönlendirilmesine izin verdi.

Bu bulgular, yeniden büyüyen aksonları hedeflerine geri yönlendiren endonöral tüpü korumak için çok önemli olan Bungner bantlarının oluşumunu teşvik etmek için bir sinir sistemi hasarında Schwann hücrelerinin hizalanması için faydalı olabilir. Schwann hücrelerini harici fiziksel tekniklerle hizalamak neredeyse imkansızdır; bu nedenle, hizalama için alternatif bir tekniğin keşfi önemlidir. Bununla birlikte, geliştirilen tekniğin dezavantajları vardır, yani manyetik alanı uzun süreler boyunca sürdürmek için önemli miktarda enerji gerektirir.

Schwann hücrelerinin göç kabiliyetini arttırmaya yönelik girişimlerde çalışmalar yapılmıştır. Schwann hücre göçü, fibronektin ve laminin gibi ECM moleküllerine sahip integrinler tarafından düzenlenir. Ek olarak, nöral hücre yapışma molekülünün ( NCAM ), in vitro Schwann hücre hareketliliğini arttırdığı bilinmektedir . NCAM, aksonal ve Schwann hücre zarlarında eksprese edilen bir glikoproteindir. Polisialik asit (PSA), polisialiltransferaz (PST) ve sialiltransferaz X (STX) tarafından NCAM üzerinde sentezlenir. CNS'nin gelişimi sırasında, NCAM üzerindeki PSA ifadesi, doğum sonrası aşamalara kadar düzenlenir. Ancak yetişkin beyninde PSA sadece yüksek plastisiteye sahip bölgelerde bulunur . Schwann hücrelerinde PSA ifadesi oluşmaz.

Lavdas et al. (2006), Schwann hücreleri üzerinde sürekli PSA ekspresyonunun göçlerini artırıp artırmadığını araştırdı. Schwann hücreleri, PSA ekspresyonunu indüklemek için STX'i kodlayan bir retroviral vektör ile transdükte edildi. PSA eksprese eden Schwann hücreleri, bir boşluk köprüleme deneyinde ve doğum sonrası ön beyin dilim kültürlerinde aşılamadan sonra gösterildiği gibi gelişmiş hareketlilik elde etti. PSA ifadesi moleküler ve morfolojik farklılaşmayı değiştirmedi. PSA eksprese eden Schwann hücreleri, normalde in vivo olarak mümkün olmayan serebellar dilimlerde CNS aksonlarını miyelinleştirebildi . Bu PSA eksprese eden Schwann hücrelerinin, miyelin oluşturma yeteneklerini kaybetmeden CNS boyunca göç edebilecekleri ve merkezi sinir sistemindeki aksonların rejenerasyonu ve miyelinasyonu için yararlı olabileceği ümit edilmektedir.

astrositler

Astrositler , merkezi sinir sisteminde bol miktarda bulunan glial hücrelerdir. Nöronların metabolik ve trofik desteği için çok önemlidirler; ayrıca astrositler iyon tamponlama ve nörotransmitter temizleme sağlar. Büyüyen aksonlar, astrositler tarafından oluşturulan ipuçları tarafından yönlendirilir; bu nedenle, astrositler, nörit yol bulmayı ve ardından gelişen beyinde kalıplamayı düzenleyebilir. Merkezi sinir sisteminde yaralanma sonrası oluşan glial skar, astrositler ve fibroblastlar tarafından oluşturulur ; yenilenmenin önündeki en önemli engeldir. Glial skar, hipertrofik astrositlerden, bağ dokusundan ve ECM'den oluşur. Nöral doku mühendisliğinin iki amacı, astrosit fonksiyonunu anlamak ve astrositik büyüme üzerinde kontrol geliştirmektir. Shany ve ark. (2006), geleneksel 2B hücre kültürlerine kıyasla 3B aragonit matrislerinde astrosit hayatta kalma oranlarının arttığını göstermiştir. Hücre süreçlerinin eğriler ve gözenekler boyunca uzanma yeteneği, karmaşık 3D konfigürasyonlara sahip çoklu hücre katmanlarının oluşumuna izin verir.

Hücrelerin 3 boyutlu bir şekil elde etmesinin üç farklı yolu şunlardır:

  1. yüzeye yapışarak ve 3D konturu takip ederek
  2. 2 eğrilik arasında bazı işlemlerin gerilmesi
  3. çok katmanlı doku içinde yer aldığında hücre katmanları içinde 3 boyutlu süreçleri genişletme

Geleneksel hücre kültüründe, büyüme bir düzlemle sınırlandırılır ve çoğu hücrenin yüzeye temas etmesiyle tek tabaka oluşumuna neden olur; bununla birlikte, aragonit yüzeyinin 3 boyutlu eğriliği, çok sayıda katmanın gelişmesine ve birbirinden çok uzaktaki astrositlerin birbiriyle temas etmesine izin verir. 3D in vivo koşullara benzer süreç oluşumunu teşvik etmek önemlidir , çünkü astrositik süreç morfolojisi, yenilenen aksonların yönlülüğünü yönlendirmede esastır. Aragonit topografisi yüksek bir yüzey alanı/hacim oranı sağlar ve kenarlardan yoksundur, bu da kültür kenarı etkisinin azalmasına yol açar. Burada bahsedilen aragonit gibi kristal matrislere , in vivo koşullara yaklaşan karmaşık bir 3D doku oluşumunun teşvik edilmesi için izin verilir .

Koku alma hücreleri

Memeli birincil koku alma sistemi , yetişkinlik döneminde sürekli olarak yenilenme yeteneğini korumuştur. Koku alma reseptör nöronlarının ortalama ömrü 6-8 haftadır ve bu nedenle yakın epitelin tabanındaki bir tabaka içinde bulunan kök hücrelerden farklılaşmış hücrelerle değiştirilmeleri gerekir. Yeni olfaktör reseptör nöronları, işlevsel olabilmek için aksonlarını CNS yoluyla bir koku ampulüne yansıtmalıdır . Aksonal büyüme, olfaktör kılıf hücrelerinin (OEC'ler) mevcudiyetine ek olarak olfaktör ampulün glial bileşimi ve sitomimarisi tarafından yönlendirilir.

OEC'lerin koku alma plakodundan kaynaklandığı ve diğer benzer sinir sistemi mikroglialarından farklı bir gelişimsel kökene işaret ettiği varsayılmaktadır .

Bir başka ilginç kavram, OEC'lerin birincil koku alma sisteminin, yani koku alma epitelyumu ve ampulün hem periferik hem de merkezi sinir sistemi bölümlerinde bulunmasıdır.

OEC'ler, yaralanmayı takiben düşük afiniteli NGF reseptörü p75'in yukarı regülasyonunu sağlamaları bakımından Schwann hücrelerine benzer ; bununla birlikte, Schwann hücrelerinin aksine, daha düşük seviyelerde nörotrofin üretirler . Birkaç çalışma, OEC'lerin lezyonlu aksonların rejenerasyonunu destekleyebildiğine dair kanıtlar göstermiştir, ancak bu sonuçlar çoğu zaman yeniden üretilemez. Ne olursa olsun, OEC'ler omurilik yaralanmaları, amyotrofik lateral skleroz ve diğer nörodejeneratif hastalıklar ile ilgili olarak kapsamlı bir şekilde araştırılmıştır . Araştırmacılar, bu hücrelerin yaralı nöronları remiyelinize etme konusunda benzersiz bir yeteneğe sahip olduğunu öne sürüyorlar.

OEC'ler , her ikisinin de viral enfeksiyona duyarlı olduğu tanımlanmış olan astrositlerinkine benzer özelliklere sahiptir.

Kök hücreler

Kök hücreler , uzun bir süre kendini yenileme ve bir veya daha fazla hücre dizisi boyunca farklılaşma yeteneğini sürdürme yetenekleriyle karakterize edilir. Kök hücreler unipotent, multipotent veya pluripotent olabilir, yani sırasıyla bir, çoklu veya tüm hücre tiplerine farklılaşabilirler. Pluripotent kök hücreler, üç embriyonik germ tabakasından herhangi birinden türetilen hücreler haline gelebilir. Kök hücreler, kültürde daha kolay çoğalabildikleri için glial hücrelere göre avantajlıdır. Bununla birlikte, bu hücreleri sıralı bir şekilde çeşitli hücre tiplerine tercihli olarak ayırt etmek zor olmaya devam etmektedir. Kök hücrelerle ilgili bir diğer zorluk, hematopoietik kök hücrelerin (HSC'ler) ötesinde iyi tanımlanmış bir kök hücre tanımının olmamasıdır. Her kök hücre 'tipi', hücreleri tanımlamak, izole etmek ve genişletmek için birden fazla yönteme sahiptir; bu çok fazla kafa karışıklığına neden oldu çünkü bir 'tip'teki tüm kök hücreler (nöral, mezenkimal, retinal) aynı koşullar altında mutlaka aynı şekilde davranmazlar.

Yetişkin kök hücreler

Yetişkin kök hücreler, in vitro olarak in vivo yapabildikleri kadar etkili bir şekilde çoğalamaz ve farklılaşamazlar . Yetişkin kök hücreler birçok farklı doku lokasyonundan gelebilir, ancak onları izole etmek zordur çünkü yüzey belirteçleriyle değil davranışla tanımlanırlar. Kök hücreler ile onları çevreleyen farklılaşmış hücreler arasında net bir ayrım yapmak için henüz bir yöntem geliştirilmemiştir. Bununla birlikte, yüzey işaretleyicileri, istenmeyen farklılaşmış hücrelerin çoğunu çıkarmak için belirli bir dereceye kadar hala kullanılabilir. Kök hücre plastisitesi, embriyonik germ hattı sınırları boyunca farklılaşma yeteneğidir. Yine de, plastisitenin varlığı ateşli bir şekilde tartışıldı. Bazıları, plastisitenin hücreler arasındaki heterojenlikten veya hücre füzyon olaylarından kaynaklandığını iddia ediyor. Şu anda hücreler, kullanılan tekniklere bağlı olarak %10 ila %90 arasında değişen verimlerle hücre çizgileri arasında farklılaştırılabilir. Verimi transdiferansiasyon ile standardize etmek için daha fazla çalışma yapılması gerekmektedir. Multipotent kök hücrelerin transdiferansiyasyonu, yetişkinlerde bulunmayan veya kolayca elde edilemeyen kök hücrelerin elde edilmesi için potansiyel bir araçtır.

Mezenkimal kök hücreler

Mezenkimal kök hücreler , kemik iliğinde bulunan yetişkin kök hücrelerdir; mezodermal kökenli soylara farklılaşabilirler. Oluşturdukları bazı doku örnekleri kemik , kıkırdak , yağ ve tendondur . MSC'ler kemik iliğinin aspirasyonu ile elde edilir. Trombosit kaynaklı büyüme faktörü , epidermal büyüme faktörü β ve insülin benzeri büyüme faktörü-1 dahil olmak üzere birçok faktör MSC'lerin büyümesini teşvik eder . Normal farklılaşma yollarına ek olarak, MSC'ler astrositler, nöronlar ve PNS miyelin hücreleri gibi mezenkimal olmayan soylar boyunca transdiferansiye olabilir. MSC'ler, sinir rejenerasyon stratejileri için potansiyel olarak yararlıdır, çünkü:

  1. kullanımları etik bir endişe değildir
  2. immünosupresyona gerek yok
  3. onlar bol ve erişilebilir bir kaynaktır
  4. genetik manipülasyonları tolere ederler

Keilhoff et al. (2006) , sıçan siyatik sinirinde 2 cm'lik bir boşluk oluşturan devitalize kas greftlerinde farklılaşmamış ve farklılaşmamış MSC'lerin sinir rejenerasyon kapasitesini Schwann hücreleriyle karşılaştıran bir çalışma gerçekleştirmiştir . Tüm hücreler otolog idi. Transdiferansiye MSC'ler, Schwann hücresi benzeri hücre oluşumunu teşvik etmek için bir faktör karışımı içinde kültürlendi. Farklılaşmamış MSC'ler hiçbir rejeneratif kapasite göstermezken, transdiferansiye MSC'ler Schwann hücrelerinin kapasitesine ulaşmasa da bir miktar rejeneratif kapasite gösterdi.

Ektomezenkimal kök hücreler

Schwann hücrelerini izole etmenin ve ardından proliferasyonu indüklemenin zorluğu büyük bir engeldir. Bir çözüm, ektomezenkimal kök hücreler (EMSC'ler) gibi hücreleri Schwann hücre benzeri fenotiplere seçici olarak indüklemektir. EMSC'ler, periferik sinir sisteminin erken gelişimi sırasında kraniyal nöral krestten ilk brankial ark içine göç eden nöral krest hücreleridir. EMSC'ler multipotenttir ve kendi kendini yenileme kapasitesine sahiptir. Dorsal kök ganglionu ve motor sinir gelişimi ile ilişkili oldukları için Schwann progenitör hücreleri olarak düşünülebilirler . EMSC farklılaşması , çevreleyen ortamdaki içsel genetik programlar ve hücre dışı sinyaller tarafından düzenleniyor gibi görünmektedir. Schwann hücreleri, sinirlerin yenilenmesi için gerekli olan hem nörotropik hem de nörotrofik faktörlerin kaynağıdır ve büyümeyi yönlendirmek için bir yapı iskelesidir. Nie, Zhang et al. PLGA kanalları içinde EMSC'lerin kültürlenmesinin faydalarını araştıran bir çalışma yürütmüştür. Bir EMSC kültürüne foskolin ve BPE eklenmesi , in vitro Schwann hücrelerinde yaygın olan uzun hücre süreçlerinin oluşumuna neden oldu . Bu nedenle, foskolin ve BPF, Schwann hücre benzeri fenotiplere farklılaşmayı indükleyebilir. BPE, MAP kinazlarını aktive ederek glial ve Schwann hücrelerinin farklılaşmasına ve çoğalmasına neden olan sitokinler GDNF , temel fibroblast büyüme faktörü ve trombosit kaynaklı büyüme faktörü içerir . PLGA kanallarına implante edildiğinde, EMSC'ler uzun süreli hayatta kalmayı sürdürdü ve genellikle çok az veya hiç rejenerasyon göstermeyen 10 mm'lik bir boşluk boyunca periferik sinir rejenerasyonunu destekledi. Greftlerin içinde miyelinli aksonlar mevcuttu ve miyelin içinde bazal laminalar oluştu. Bu gözlemler, EMSC'lerin kanal içindeki rejenere sinir liflerinin miyelinasyonunu destekleyebileceğini düşündürmektedir.

Sinir progenitör hücreleri

Nöronları biyoyapay sinir kanalına yerleştirmek, hasarlı sinirleri değiştirmenin en bariz yöntemi gibi görünüyor; bununla birlikte, nöronlar çoğalamaz ve kültürde genellikle kısa ömürlüdürler. Bu nedenle, nöral progenitör hücreler, hasar görmüş ve dejenere olmuş nöronları değiştirmek için daha umut verici adaylardır, çünkü bunlar kendi kendini yeniler, bu da birçok hücrenin minimal donör materyali ile in vitro üretimine izin verir . Nöral progenitör hücrelerden oluşan yeni nöronların fonksiyonel bir ağın parçası olduğunu doğrulamak için sinaps oluşumunun varlığı gereklidir. Ma, Fitzgerald ve ark. bir 3D kollajen matrisi üzerinde murin nöral sapı ve progenitör hücre kaynaklı fonksiyonel sinaps ve nöronal ağ oluşumunun ilk gösterimidir. Nöral progenitör hücreler genişledi ve kendiliğinden uyarılabilir nöronlara farklılaştı ve sinapslar oluşturdu; ayrıca, üç nöral doku soyuna farklılaşma yeteneğini korudular. Ayrıca sadece aktif sinaptik vezikül geri dönüşümünün meydana gelmediği, aynı zamanda kendiliğinden aksiyon potansiyelleri oluşturabilen uyarıcı ve engelleyici bağlantıların da oluştuğu gösterildi. Bu nedenle, nöral progenitör hücreler, fonksiyonel nöronlar yaratmak için uygun ve nispeten sınırsız bir kaynaktır.

sinir kök hücreleri

Nöral kök hücreler (NSC'ler) kendi kendini yenileme ve nöronal ve glial soylara farklılaşma yeteneğine sahiptir. NSC farklılaşmasını yönlendirmek için birçok kültür yöntemi geliştirilmiştir; bununla birlikte, NSC farklılaşmasını yönlendirmek için biyomalzemelerin yaratılması, klinik olarak daha uygun ve kullanılabilir bir teknoloji olarak görülmektedir. NSC farklılaşmasını yönlendirmek için bir biyomateryal geliştirmeye yönelik bir yaklaşım, hücre dışı matris (ECM) bileşenlerini ve büyüme faktörlerini birleştirmektir. Nakajima, Ishimuro ve ark. Bir büyüme faktörü ve bir ECM bileşeninden oluşan farklı moleküler çiftlerin, NSC'lerin astrositlere ve nöronal hücrelere farklılaşması üzerindeki etkilerini inceledi. İncelenen ECM bileşenleri, doğal ECM bileşenleri olan laminin-1 ve fibronektin ile yapay ECM bileşenleri olan ProNectin F plus (Pro-F) ve ProNectin L (Pro-L) ve poli(etilenimin) (PEI) idi. Nörotrofik faktörler kullanıldı , epidermal büyüme faktörü (EGF), fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF-2), sinir büyüme faktörü (NGF), nörotrofin-3 (NT-3) ve göz kapağı nevrotrop faktörü (CNTF). Çift kombinasyonları, üzerinde NSC'lerin kültürlendiği matris hücre dizileri üzerinde hareketsizleştirildi. Kültürde 2 gün geçtikten sonra hücreler, karşı antikorlar ile boyandı Nestin , β- tübülin III ve GFAP sırasıyla NSC'lerde için belirteçler, nöronal hücrelerde ve astrosit olduğu,. Sonuçlar, NSC'lerin farklılaşmasını yönlendirmek için bir biyomateryal geliştirmek için pratik bir yöntem olarak ECM bileşenlerinin ve büyüme faktörlerinin avantajlı kombinasyonları hakkında değerli bilgiler sağlar.

nörotrofik faktörler

Şu anda, nörotrofik faktörler , akson büyümesini ve rejenerasyonunu yönlendirmek için in vivo gerekli olduklarından, biyoyapay sinir kanallarında kullanım için yoğun bir şekilde araştırılmaktadır . Çalışmalarda, nörotrofik faktörler normalde hücrelerin ve spesifik topografyaların eklenmesiyle oluşturulan biyolojik ve fiziksel ipuçları gibi diğer tekniklerle birlikte kullanılır. Nörotrofik faktörler, iskele yapısına sabitlenebilir veya sabitlenmeyebilir, ancak sabit, kontrol edilebilir gradyanların oluşturulmasına izin verdiği için immobilizasyon tercih edilir. Nöral ilaç verme sistemleri gibi bazı durumlarda, belirli zamanlarda ve belirli miktarlarda seçici olarak salınabilmeleri için gevşek bir şekilde hareketsiz hale getirilirler. İlaç verme, sinir kılavuz kanallarına büyüme faktörlerinin eklenmesinin ötesindeki bir sonraki adımdır.

biyomimetik malzemeler

Sinir kılavuz kanalları için kullanılan birçok biyomateryal, biyomimetik materyallerdir . Biyomimetik malzemeler, ECM proteinlerinden yapı iskelesine bağlı peptitler ile etkileşimlerin aracılık ettiği belirli hücresel tepkileri ortaya çıkaracak şekilde tasarlanmış malzemelerdir; esasen, hücre bağlayıcı peptitlerin kimyasal veya fiziksel modifikasyon yoluyla biyomateryallere dahil edilmesi.

sinerjizm

Sinerjizm genellikle iki unsur birleştirildiğinde ortaya çıkar; her bir unsurun ayrı ayrı birleşik etkilerinden daha büyük bir etkiye neden olan iki unsur arasındaki bir etkileşimdir. İskele malzemesi ve topografinin hücresel terapiler, nörotrofik faktörler ve biyomimetik malzemelerle birleştirilmesinde sinerji belirgindir. Sinerjizmin araştırılması, bireysel tekniklerin kendi başlarına başarılı olduklarını kanıtladıktan sonraki adımdır. Sinerjik etkileri optimize etmek için bu farklı faktörlerin kombinasyonlarının dikkatlice incelenmesi gerekir.

Nörotrofik faktör kombinasyonlarını optimize etme

Nörotrofik faktörler arasındaki etkileşimlerin her bir faktörün optimal konsantrasyonlarını değiştirebileceği varsayılmıştır. Hücrenin hayatta kalması ve fenotip bakımı önemli olmakla birlikte, değerlendirmenin vurgusu nörit uzantısı üzerindeydi. NGF , glial hücre dizisinden türetilen nörotrofik faktör ( GDNF ) ve siliyer nörotrofik faktörün ( CNTF ) bir kombinasyonu, in vitro olarak Dorsal kök ganglion kültürlerine sunuldu . Her nörotrofik aileden bir faktör kullanıldı. Bireysel optimal konsantrasyon ve kombinatoryal optimal konsantrasyonda bir fark olmadığı belirlendi; ancak, 5. veya 6. gün civarında nöritler uzamayı durdurdu ve bozulmaya başladı. Bunun kritik bir besin maddesinin veya uygun gradyanların eksikliğinden kaynaklandığı varsayıldı; önceki çalışmalar, büyüme faktörlerinin, gradyanlarda sunulduğunda en iyi nörit uzantısını optimize edebildiğini göstermiştir. Nörotrofik faktör kombinasyonları üzerine gelecekteki çalışmaların gradyanları içermesi gerekecektir.

Nöral hücre adezyon moleküllerinin ve GFD-5'in kombinasyonu

Biyouyumlu matrislere gömülü hücre yapışma molekülleri (CAM'ler) ve nörotrofik faktörler, araştırılan nispeten yeni bir kavramdır. Kamları immünoglobülin süper ailesinin bu nöronları veya Schwann hücrelerinin gelişmekte olan sinir sistemi içinde eksprese edildiğinden, L1 / NgCAM ve nörofaskin içerir (IgSF), özellikle de ümit vericidir. Kılavuz ipuçları olarak hizmet ettikleri ve nöronal farklılaşmaya aracılık ettikleri bilinmektedir. Bununla birlikte, NGF ve büyüme farklılaşma faktörü 5 (GDF-5) gibi nörotrofik faktörler , in vivo rejenerasyonun destekleyicileri olarak iyi bilinmektedir . Niere, Brown ve ark. L1 ve nörofassini NGF ve GDF-5 ile birleştirmenin kültürdeki DRG nöronları üzerindeki sinerjistik etkilerini araştırdı; bu kombinasyon nörit büyümesini arttırdı. L1 ve nörofassini yapay bir füzyon proteininde birleştirerek daha fazla geliştirme gösterildi, bu da faktörler tek tek iletilmediği için verimliliği artırdı. Sadece farklı ipuçları kullanılabilir, aynı zamanda tek bir 'yeni' ipucunda kaynaştırılabilirler.

Kimyasal ve biyolojik ipuçlarıyla sinerji içinde topografya

Kimyasal, fiziksel ve biyolojik ipuçları gibi çoklu uyaran türlerinin nöral progenitör hücre farklılaşması üzerindeki etkisi araştırılmamıştır. Yetişkin sıçan hipokampal progenitör hücrelerine (AHPC'ler) üç farklı uyaranın sunulduğu bir çalışma yürütülmüştür: doğum sonrası sıçan tip-1 astrositleri (biyolojik), laminin (kimyasal) ve mikro desenli substrat (fiziksel). AHPC'lerin %75'inden fazlası, desenli olmayan alt tabakalardaki rastgele büyümeye kıyasla olukların 20° içinde hizalanmıştır. AHPC'ler astrositlerle mikro desenli substratlar üzerinde büyütüldüğünde, büyüme oluklar ile hizalanmış astrositlerden etkilenmiştir; yani, AHPC'ler astrositik hücre iskeleti filamentleri boyunca süreçleri genişletti. Bununla birlikte, hizalama, kültürdeki AHPC'lerin mikro desenli substrat ile tek başına gördüğü kadar önemli değildi. Farklılaşmanın bir sonucu olarak ifade edilen farklı fenotipleri değerlendirmek için hücreler, sınıf III β-tubulin (TuJI), reseptör etkileşimli protein (RIP) ve glial fibriler asidik protein (GFAP) için işaretleyiciler olan antikorlarla boyandı. sırasıyla erken nöronlar, oligodendrositler ve astrositler. En büyük farklılaşma miktarı, astrositlerle desenli substratlar üzerinde kültürlenen AHPC'lerde görüldü.

Referanslar

Dış bağlantılar