Çok odaklı dizi yazma - Multilocus sequence typing

Multilocus sekans tiplemesi ( MLST ), moleküler biyolojide çoklu lokusların tiplendirilmesine yönelik bir tekniktir . Prosedür , çoklu temizlik genlerinin dahili fragmanlarının DNA dizilerini kullanarak mikrobiyal türlerin izolatlarını karakterize eder . Her bir genin yaklaşık 450-500 bp dahili fragmanı kullanılır, çünkü bunlar otomatik bir DNA sıralayıcı kullanılarak her iki zincirde de doğru bir şekilde sıralanabilir. Her bir temizlik geni için, bir bakteri türü içinde bulunan farklı diziler, farklı aleller olarak atanır ve her izolat için, lokusların her birinde bulunan aleller, alelik profili veya dizi tipini (ST) tanımlar.

Geliştirilecek ilk MLST şeması , meningokokal menenjit ve septiseminin etken maddesi olan Neisseria meningitidis içindi . MLST, evrimsel tarih araştırmalarına girişinden bu yana sadece insan patojenleri için değil, aynı zamanda bitki patojenleri için de kullanılmıştır.

Prensip

MLST, bir dizi temizlik genindeki DNA dizisi varyasyonlarını doğrudan ölçer ve suşları benzersiz alelik profilleriyle karakterize eder. MLST'nin prensibi basittir: teknik, PCR amplifikasyonunu ve ardından DNA dizilimini içerir . Suşlar arasındaki nükleotid farklılıkları, istenen ayrım derecesine bağlı olarak değişken sayıda gende kontrol edilebilir.

MLST'nin iş akışı şunları içerir: 1) veri toplama, 2) veri analizi ve 3) çok noktalı dizi analizi. Veri toplama adımında, gen fragmanlarının nükleotid dizi belirlemesi ile varyasyonun kesin tanımlaması elde edilir. Veri analizi adımında, tüm benzersiz dizilere alel numaraları atanır ve bir alelik profilde birleştirilir ve bir dizi tipine (ST) atanır. Yeni aleller ve ST'ler bulunursa, doğrulamadan sonra veri tabanında saklanırlar. MLST'nin son analiz adımında, alelik profiller karşılaştırılarak izolatların akrabalıkları yapılır. Araştırmacılar, farklı klonal komplekslerin ST'lerini karşılaştırarak epidemiyolojik ve filogenetik çalışmalar yaparlar. Sıralama ve tanımlama işlemi sırasında çok büyük bir veri seti üretilir, bu nedenle tüm biyolojik verileri düzenlemek, yönetmek, analiz etmek ve birleştirmek için biyoinformatik teknikler kullanılır.

Suş tiplemesi için kabul edilebilir tanımlama gücü, zaman ve maliyet arasındaki dengeyi sağlamak için, laboratuvarlarda yaklaşık yedi ila sekiz ev tutma geni yaygın olarak kullanılmaktadır. Örnek olarak Staphylococcus aureus'tan alıntı yaparsak, MLST tiplemesinde yedi temizlik geni kullanılır. Bu genler, karbamat kinaz (içerir ARCC ), şikimat dehidrojenaz ( aroE ), gliserol kinazın ( glpF ), guanilat kinaz ( GMK ), fosfat asetiltransferazı ( PTA ), triosefosfat izomeraz ( TPI ) ve asetil koenzim A asetiltransferaz ( yqiL belirtildiği gibi) MLST web sitesi. Bununla birlikte, on taneye kadar temizlik geninin kullanılması nadir değildir. İçin Vibrio vulnificus , kullanılan referans geni glukoz-6-fosfat izomeraz (vardır GLP ), DNA giraz, alt birimi B ( gyrB ), malat-laktat dehidrojenaz ( MDH ), metionil-tRNA sentetaz ( metG ), phosphoribosylaminoimidazole sentetaz ( purM ), treonin dehidrojenaz ( dtdS ), diaminopimelat dekarboksilaz ( lysA ), transhidrojenaz alfa alt birimi ( pntA ), dihidroorotaz ( pyrC ) ve triptofanaz ( tnaA ). Bu nedenle, MLST tarafından sorgulanan temizlik genlerinin hem sayısı hem de türü türden türe farklılık gösterebilir.

Bu temizlik genlerinin her biri için farklı diziler alel olarak atanır ve lokuslardaki aleller bir alel profili sağlar. Daha sonra bir dizi profil, gerinim tiplemesi için tanımlama işareti olabilir. Tek bir nükleotidde bile farklılık gösteren diziler, farklı aleller olarak atanır ve aleller arasındaki nükleotid farklılıklarının sayısını hesaba katmak için herhangi bir ağırlık verilmez, çünkü çoklu nükleotit bölgelerindeki farklılıkların çoklu nokta mutasyonlarının mı yoksa tek bir mutasyonun sonucu mu olduğunu ayırt edemeyiz. rekombinasyonel değişim. Lokusların her birinde çok sayıda potansiyel alel, milyarlarca farklı alelik profili ayırt etme yeteneği sağlar ve her lokusta en yaygın alel bulunan bir suşun, yaklaşık olarak 10.000 izolatta bir tesadüfen meydana gelmesi beklenir. MLST'nin yüksek ayrım gücü sağlamasına rağmen, temizlik genlerinde nükleotid değişikliklerinin birikmesi nispeten yavaş bir süreçtir ve bir bakteri izolatının alelik profili , yöntemin küresel epidemiyoloji için ideal olması için zaman içinde yeterince kararlıdır.

Bir şekilde izolatların ilişkililiği gösterilir dendrogramını bunların alelik profil arasındaki çiftli farklar matrisini kullanarak inşa eburst veya en az bir kapsayan ağacın (MST). Dendrogram, ortak bir atadan türetildiği varsayılabilen aynı veya çok benzer alelik profillere sahip olan izolatları göstermenin yalnızca uygun bir yoludur; yedi lokustan üçünden fazlasında farklılık gösteren izolatlar arasındaki ilişkilerin güvenilmez olması muhtemeldir ve onların filogenilerini çıkarsamak için alınmamalıdır. MST, tüm örnekleri, ağacın tüm dallarının toplam mesafesi minimum olacak şekilde birleştirir.

Alternatif olarak, izolatların akrabalıkları da şu şekilde analiz edilebilir: MultiLocus Dizi Analizi ( MLSA ). Bu, atanan alelleri kullanmaz, bunun yerine temizlik genlerinin gen fragmanlarının dizilerini birleştirir ve filogenetik ilişkileri belirlemek için bu birleştirilmiş diziyi kullanır. MLST'nin aksine, bu analiz, yalnızca tek bir nükleotid farklılık gösteren diziler arasında daha yüksek bir benzerlik ve çoklu nükleotid farklılıkları olan diziler arasında daha düşük bir benzerlik atar. Sonuç olarak, bu analiz klonal evrime sahip organizmalar için daha uygundur ve rekombinasyon olaylarının çok sık meydana geldiği organizmalar için daha az uygundur. Yakın akraba türler arasındaki filogenetik ilişkileri belirlemek için de kullanılabilir. MLST ve MLSA terimleri sıklıkla birbirinin yerine kullanılabilir olarak kabul edilir. Ancak her analiz yönteminin kendine özgü özellikleri ve kullanımları olduğu için bu doğru değildir. Doğru terimi kullanmaya özen gösterilmelidir.

Diğer tekniklerle karşılaştırma

Bakteriyel izolatları ayırt etmek için daha önceki serolojik tiplendirme yaklaşımları kurulmuştu, ancak immünolojik tiplendirmenin birkaç antijenik lokusa güvenme ve farklı antijenik varyantlara sahip antikorların öngörülemeyen reaktiviteleri gibi dezavantajları vardır. Darbeli alan jel elektroforezi ( PFGE ), ribotipleme ve PCR tabanlı parmak izi gibi patojenlerin ilişkisini belirlemek için çeşitli moleküler tiplendirme şemaları önerilmiştir . Ancak bu DNA bantlarına dayalı alt tipleme yöntemleri, anlamlı evrimsel analizler sağlamaz. PFGE'nin birçok araştırmacı tarafından “altın standart” olarak görülmesine rağmen, işlem sırasında DNA'nın bozunması (jel smear) nedeniyle birçok suş bu teknikle tiplendirilemez.

MLST'nin yaklaşımı, çok çekirdekli metabolik enzimlerin farklı elektroforetik hareketliliklerine (EM) dayanan Çok lokuslu enzim elektroforezinden (MLEE) farklıdır. Enzimler arasındaki farklı amino asit dizileri bir jel üzerinde çalıştırıldığında farklı hareketliliklere ve farklı bantlara neden olduğundan, her lokustaki aleller ürünlerinin EM'sini tanımlar. İzolatların ilişkisi daha sonra elektroforetik tipler arasındaki ikili farklılıkların matrisinden üretilen bir dendrogram ile görselleştirilebilir. Bu yöntemin çeşitli nedenlerle MLST'den daha düşük bir çözünürlüğü vardır, bunların tümü enzimatik fenotip çeşitliliğinin yalnızca DNA dizi çeşitliliği için bir vekil olduğu gerçeğinden kaynaklanır. İlk olarak, enzimler, farklı bantlar vermek için yeterince farklı EM'ye sahip olmaksızın farklı amino asit dizilerine sahip olabilir. İkincisi, "sessiz mutasyonlar", kodlanmış amino asitleri değiştirmeden bir genin DNA dizisini değiştirebilir. Üçüncüsü, enzimin fenotipi, çevresel koşullara yanıt olarak kolayca değiştirilebilir ve MLEE sonuçlarının tekrarlanabilirliğini kötü bir şekilde etkileyebilir - enzimlerin ortak modifikasyonları fosforilasyon, kofaktör bağlanması ve taşıma dizilerinin bölünmesidir. Bu aynı zamanda farklı laboratuvarlar tarafından elde edilen MLEE verilerinin karşılaştırılabilirliğini sınırlarken, MLST taşınabilir ve karşılaştırılabilir DNA dizisi verileri sağlar ve otomasyon ve standardizasyon için büyük potansiyele sahiptir.

MLST, DNA barkodlama ile karıştırılmamalıdır . İkincisi, belirli ökaryot türlerini tanımak için kısa genetik belirteçler kullanan taksonomik bir yöntemdir. Mitokondriyal DNA'nın (mtDNA) veya ribozomal DNA cistronunun bazı bölümlerinin, türler arasında dizilerde önemli farklılıklar sağlayan nispeten hızlı mutasyon oranlarına sahip olduğu gerçeğine dayanmaktadır . mtDNA yöntemleri yalnızca ökaryotlarda mümkündür (prokaryotlarda mitokondri bulunmadığından), MLST, başlangıçta prokaryotlar için geliştirilmiş olmasına rağmen, şimdi ökaryotlarda uygulama bulmaktadır ve prensipte herhangi bir krallığa uygulanabilir.

Avantajlar ve uygulamalar

MLST, son derece açık ve taşınabilirdir. ST tayini için gerekli malzemeler laboratuvarlar arasında değiştirilebilir. Primer dizileri ve protokollerine elektronik olarak erişilebilir. Tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir. MLST otomatiktir, yüksek verimli dizileme ve biyoinformatikteki ilerlemeleri yerleşik popülasyon genetiği teknikleriyle birleştirir. MLST verileri, bakteriler arasındaki evrimsel ilişkileri araştırmak için kullanılabilir. MLST, izolatları ayırt etmek için iyi bir ayrım gücü sağlar.

MLST'nin uygulaması çok büyüktür ve gıda endüstrisinin yanı sıra bilim, halk sağlığı ve veterinerlik toplulukları için bir kaynak sağlar. Aşağıdakiler, MLST uygulamalarının örnekleridir.

kampilobakter

Campylobacter , genellikle az pişmiş kümes hayvanları veya pastörize edilmemiş sütten kaynaklanan bakteriyel enfeksiyöz bağırsak hastalıklarının ortak etkenidir. Bununla birlikte, salgınlar nadiren tespit edildiğinden epidemiyolojisi yeterince anlaşılmamıştır, bu nedenle salgının kaynakları ve bulaşma yolları kolayca izlenemez. Ek olarak, Campylobacter genomları, birçok tipleme yönteminden elde edilen verilerin yorumlanmasını zorlaştıran faz varyasyonu ile birlikte sık intergenomik ve intragenomik rekombinasyon ile genetik olarak çeşitlidir ve kararsızdır. Yakın zamana kadar MLST tekniğinin uygulanması ile Campylobacter tiplemesi büyük bir başarı elde etmiş ve MLST veri tabanına eklenmiştir. 1 Mayıs 2008 itibariyle, Campylobacter MLST veritabanı 3516 izolat ve Campylobacter araştırmalarında MLST'yi kullanan veya bundan bahseden yaklaşık 30 yayın içermektedir( http://pubmlst.org/campylobacter/ ).

Neisseria meningitidis

MLST, insan popülasyonları içinde ve insan, bitki ve hayvanlar için patojen olabilecek suş varyantları üzerinde daha zengin dokulu bir bakteri resmi sağlamıştır. MLST tekniği ilk olarak Maiden ve ark. (1) altı lokus kullanarak Neisseria meningitidis'i karakterize etmek . MLST'nin uygulanması, dünya çapında invaziv hastalıklardan sorumlu olduğu bilinen ana meningokok soylarını açıkça çözmüştür. Ana istilacı soylar arasındaki ayrım gücü seviyesini geliştirmek için, yedi lokus kullanılmakta ve birçok laboratuvar tarafından meningokok izolatlarını karakterize etmek için tercih edilen yöntem olarak kabul edilmektedir. N. meningitidis'te rekombinasyon değişimlerinin yaygın olarak meydana geldiği ve meningokok klonlarının hızla çeşitlenmesine yol açtığı iyi bilinen bir gerçektir . MLST, klonal çeşitlendirme oranlarının genellikle daha düşük olduğu diğer bakteri türleri içindeki klonların karakterizasyonu için başarılı bir şekilde güvenilir bir yöntem sağlamıştır.

stafilokok aureus

S. aureus bir dizi hastalığa neden olur. Metisiline dirençli S. aureus ( MRSA ), vankomisin dışında hemen hemen tüm antibiyotiklere direnci konusunda artan endişeler yaratmıştır. Ancaktoplumdaki ve hastanelerdekiçoğu ciddi S. aureus enfeksiyonlarına metisiline duyarlı izolatlar (MSSA) neden olur ve ciddi hastalıklarla ilişkili hipervirülent MSSA klonlarını tanımlamaya yönelik çok az girişim olmuştur. Bu nedenle MLST, MRSA klonlarını karakterize etmek için açık bir yöntem sağlamak ve ciddi hastalıklarla bağlantılı MSSA klonlarının tanımlanması için geliştirilmiştir.

Streptococcus pyogenes

S. pyogenes farenjitten nekrotizan fasiit dahil hayatı tehdit eden impetigoya kadar çeşitli hastalıklara neden olur. S. pyogenes için bir MLST şemasıgeliştirilmiştir. Şu anda, veritabanı ( mlst.net ), organizmanın dünya çapındaki çeşitliliğini temsil eden izolatların alelik profillerini içerir ve ciddi invaziv hastalıklardan izole edilir.

Candida albicans

C. albicans , insanlarda görülen bir mantar patojenidir ve hastane kaynaklı kan dolaşımı enfeksiyonlarından sorumludur. C. albicans izolatlarınıkarakterize etmek için MLST tekniği kullanılmıştır. Alellerin farklı lokuslardaki kombinasyonu, suşları ayırt etmek için kullanılabilecek benzersiz diploid dizi tipleriyle sonuçlanır. MLST'ninhastanede C. albicans epidemiyolojisininyanı sırainsan ve hayvan konakları da dahil olmak üzere çeşitli ekolojik nişlerden elde edilen C. albicans izolatlarınınçeşitliliğiniincelemek için başarıyla uygulandığı gösterilmiştir.

Kronobakter

Cronobacter cinsi 7 türden oluşur. 2007'den önce, bu organizmalara tek tür adı Enterobacter sakazakii uygulanıyordu. Cronobacter MLST başlangıçta birbirinden ayırt uygulandı C sakazakii'nin ve C malonaticus 16S rDNA dizileme doğru her zaman yeterli değildir, ve çok Biyotiplendirme ilgili olduğu için. Cronobacter MLST düzeni 7 alleli kullanır; atpD , fusA , glnS , gltB , gyrB , infB ve ppsA filogenetik analiz (MLSA) ve karşılaştırmalı genomik için 3036 bp'lik bir sıralı dizi verir. MLST, yeni Cronobacter türlerinin resmi olarak tanınmasında da kullanılmıştır . Yöntem, bir genetik soy, sekans tip 4 (ST4) ve neonatal menenjit vakaları arasında güçlü bir ilişki olduğunu ortaya çıkarmıştır. Cronobacter MLST sitesi http://www.pubMLST.org/cronobacter adresindedir .

sınırlamalar

MLST, popülasyon genetik çalışmasında en iyi şekilde görünür ancak pahalıdır. Temizlik genlerindeki sekans korunumu nedeniyle, MLST bazen bakteri suşlarını ayırt etmek için ayrım gücünden yoksundur ve bu da epidemiyolojik araştırmalarda kullanımını sınırlar. MLST'nin ayırt edici gücünü geliştirmek için Listeria monocytogenes kullanılarak bir çoklu virülans lokus dizi tipleme (MVLST) yaklaşımı geliştirilmiştir . MVLST, MLST'nin faydalarını genişletir ancak temizlik genlerinden daha polimorfik olabilen virülans genlerini hedefler. Bir salgında tek ilgili faktör popülasyon genetiği değildir. Virülans faktörleri de hastalığa neden olmada önemlidir ve popülasyon genetiği çalışmaları bunları izlemek için mücadele eder. Bunun nedeni, ilgili genlerin, popülasyon genetik çerçevesi ile karşılaştırıldığında, suşlar arasında sıklıkla yüksek oranda yeniden birleştirici ve hareketli olmasıdır. Bu nedenle, örneğin Escherichia coli'de toksin genleri taşıyan suşların belirlenmesi, yaygın suşların popülasyon genetiğine dayalı bir değerlendirmesine sahip olmaktan daha önemlidir.

İkinci nesil dizileme teknolojilerinin ortaya çıkışı, göreceli olarak mütevazı bir maliyet ve çabayla tüm bakteri genomu boyunca dizi bilgisi elde etmeyi mümkün kılmıştır ve MLST, şimdi olduğu gibi her bir lokusun ayrı ayrı dizilenmesi yerine tüm genom dizi bilgisinden atanabilir. MLST'nin ilk geliştirildiği zamanki uygulama. Tüm genom dizilimi, bakteri suşlarını ayırt etmek için daha zengin bilgiler sağlar (MLST, bakteri genomunun geri kalanını göz ardı ederken tip atamak için genomik dizinin yaklaşık %0,1'ini kullanır). Örneğin, çok sayıda izolatın tam genom dizilimi, Klebsiella pneumoniae'nin tek MLST soyunun ST258'in iki farklı genetik klad içerdiğini ortaya çıkarmış, bu çoklu ilaca dirençli organizmaların evrimi ve yayılması hakkında ek bilgi sağlar ve önceki tek bir teklinin hipotezini çürütür. ST258 için klonal orijin.

veritabanları

MLST veri tabanları, her organizma için referans alel dizileri ve dizi tiplerini içerir ve ayrıca epidemiyolojik verileri izole eder. Web siteleri, kullanıcıların alel dizilerini ve dizi türlerini sorgulamasına olanak tanıyan sorgulama ve analiz yazılımı içerir. MLST, araştırmacılar ve kamu sağlık çalışanları için yaygın olarak bir araç olarak kullanılmaktadır.

MLST veritabanlarının çoğu şu anda Imperial College, Londra'da ( mlst.net ) ve Oxford Üniversitesi'nde ( pubmlst.org ) bulunan 2 web sunucusunda barındırılmaktadır .

Her sitede barındırılan veri tabanları farklıdır ve organizmaya özel referans alel dizilerini ve bireysel organizmalar için ST listelerini tutar.

Kullanılan dizilerin toplanmasına ve biçimlendirilmesine yardımcı olmak için Firefox için basit ve ücretsiz bir eklenti geliştirilmiştir ( link ).

Referanslar

Dış bağlantılar

dergi makaleleri