atlama kitaplığı - Jumping library
Sıçrayan kitaplıklar veya bağlantı parçası kitaplıkları, kromozom sıçraması tarafından üretilen genomik DNA parçalarının koleksiyonlarıdır . Bu kütüphaneler, genomun geniş alanlarının analizine izin verir ve yaygın klonlama tekniklerindeki mesafe sınırlamalarının üstesinden gelir. Bir atlama kitaplığı klonu, genellikle birbirinden birçok kilobaz uzakta bulunan iki DNA uzantısından oluşur. Bu iki "uç" arasında yer alan DNA uzantısı, bu klonlama tekniğinin başlangıcında gerçekleştirilen bir dizi biyokimyasal manipülasyonla silinir.
Buluş ve erken iyileştirmeler
Menşei
Kromozom sıçraması (veya kromozom sıçraması) ilk olarak 1984 yılında Collins ve Weissman tarafından tanımlanmıştır . O zamanlar, klonlama teknikleri sınırlı boyutta (240 kb'ye kadar) klonların üretilmesine izin verdi ve sitogenetik teknikler, bu tür klonların belirli bir kromozomun küçük bir bölgesine yaklaşık 5-10 Mb çözünürlükte eşlenmesine izin verdi. Bu nedenle, mevcut teknolojiler arasında çözünürlükte büyük bir boşluk kaldı ve genomun daha geniş alanlarını haritalamak için hiçbir yöntem mevcut değildi.
Temel ilke ve orijinal yöntem
Bu teknik, kromozom boyunca daha büyük "adımlara" izin veren "kromozom yürüyüşü"nün bir uzantısıdır. N kb uzunluğunda adımlar isteniyorsa, çok yüksek moleküler ağırlıklı DNA gereklidir. İzole edildikten sonra, sık kesen bir kısıtlama enzimi (MboI veya BamHI gibi ) ile kısmen sindirilir . Daha sonra, N kb uzunluğunda olması gereken boyut için elde edilen parçalar seçilir. Daha sonra DNA, multimerlerin oluşumundan ziyade dairelere bağlanmasını desteklemek için düşük konsantrasyonda bağlanmalıdır. Bir DNA markörü (kehribar supresör tRNA geni supF gibi) bu zaman noktasında bağlantı parçalarının seçilmesine izin vermek için kovalent olarak bağlı daire içine dahil edilebilir. Daireler daha sonra çok sayıda parça üretmek için ikinci bir kısıtlama enzimi ( EcoRI gibi ) ile tamamen sindirilir . Bu tür fragmanlar, daha önce tanıtılan DNA işaretleyicisini kullanmak için seçilmesi gereken vektörlere (bir A vektörü gibi) bağlanır. Kalan parçalar böylece bağlantı parçaları kitaplığını veya "atlama kitaplığını" temsil eder. Bir sonraki adım, istenen "kromozom sıçramasının" bir "başlangıç noktasını" temsil eden, yani sorgulanan genomun konumunu belirleyen bir sonda ile bu kitaplığı taramaktır. Bu son seçim adımından elde edilen klonlar, orijinal olarak N kb uzaklıkta bulunan (böylece "zıplama" olarak adlandırılır) başka bir DNA dizisinden DNA işaretçimiz tarafından ayrılan, probumuza homolog olan DNA'dan oluşacaktır. Farklı N değerlerine sahip birkaç kitaplık oluşturularak, sonunda tüm genom haritalanabilir ve istenen herhangi bir N değeri ile yönü kontrol ederken bir konumdan diğerine hareket sağlar.
Erken zorluklar ve iyileştirmeler
Orijinal kromozom atlama tekniği, New Haven, ABD'deki Yale Üniversitesi'ndeki Collins ve Weissman laboratuvarlarında ve Almanya, Heidelberg'deki Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarı'ndaki Poustka ve Lehrach laboratuvarlarında geliştirildi.
Collins ve Weissman'ın yukarıda açıklanan yöntemi bazı erken sınırlamalarla karşılaştı. Ana endişe, dairesel olmayan parçalardan kaçınmaktı. İki çözüm önerildi: ya belirli bir sonda ile bağlantı parçalarının taranması ya da tek dairesel klonları (monomerler) birbirine bağlanmış klonlardan (multimerler) ayırmak için ligasyondan sonra ikinci bir boyut seçme aşamasının eklenmesi. Yazarlar ayrıca, birleşme klonlarının seçimini kolaylaştırmak için λ cos bölgesi veya antibiyotik direnç genleri gibi diğer belirteçlerin (amber baskılayıcı tRNA geni yerine) dikkate alınması gerektiğini öne sürdüler.
Poustka ve Lehrach, kütüphane yapısının ilk adımı için, sık kesen bir kısıtlama enzimi ile kısmi sindirim yerine, nadir kesme kısıtlama enzimleri (NotI gibi) ile tam sindirimin kullanılması gerektiğini öne sürdüler. Bu, klon sayısını önemli ölçüde milyonlardan binlere indirecektir. Bununla birlikte, bu parçalar çok uzun olacağından ve ayrıca kısmi özetlerde elde edilen uç noktaların seçimindeki esnekliği kaybedeceğinden, bu DNA parçalarının daireselleştirilmesinde sorunlar yaratabilir. Bu problemlerin üstesinden gelmek için bir öneri, iki yöntemi birleştirmek, yani kısmen yaygın olarak kesen bir kısıtlama enzimi ve tamamen nadir bir kesici kısıtlama enzimi ile sindirilmiş DNA parçalarından bir atlama kitaplığı oluşturmak ve bunları her iki enzimle bölünmüş plazmitler halinde daireselleştirmek olabilir. Bu "kombinasyon" kitaplıklarının birçoğu 1986'da tamamlandı.
1991 yılında Zabarovsky ve ark. atlama kitaplıklarının inşası için yeni bir yaklaşım önerdi. Bu yaklaşım, kütüphane yapımı için iki ayrı λ vektörünün kullanımını ve seçilebilir bir işaretçi ihtiyacını ortadan kaldıran kısmi bir doldurma reaksiyonunu içeriyordu. Bu doldurma reaksiyonu, bağlanmamış ve dairesel olmayan DNA fragmanlarının spesifik kohezif uçlarını (kısıtlama sindirimlerinden kaynaklanan) yok ederek ve böylece daha enerji verimli ve doğru bir şekilde vektörlere klonlanmalarını önleyerek çalıştı. Ayrıca, bu gelişmiş teknik, başlangıçta daha az DNA gerektirdi ve aynı zamanda, bir plazmit formuna aktarılabilen bir kitaplık üreterek, saklamayı ve kopyalamayı kolaylaştırdı. Bu yeni yaklaşımı kullanarak, bir lenfoblastoid hücre dizisinden bir insan NotI atlama kitaplığı ve bir insan kromozomu 3 ve fare hibrit hücre dizisinden bir insan kromozomu 3-spesifik NotI atlama kitaplığı başarıyla oluşturdular.
Geçerli yöntem
İkinci nesil veya "Yeni Nesil" (NGS) teknikleri radikal bir şekilde gelişti: sıralama kapasitesi on bin kattan fazla arttı ve maliyet 2007'den bu yana bir milyon kattan fazla düştü (Ulusal İnsan Genomu Araştırma Enstitüsü). NGS, genetik alanda birçok yönden devrim yarattı.
Kütüphane inşaatı
Bir kütüphane genellikle DNA'nın rastgele parçalanması ve ortak adaptör dizilerinin ligasyonu ile hazırlanır. Bununla birlikte, oluşturulan kısa okumalar, indeller, translokasyonlar ve çoğaltma gibi yapısal varyantların tanımlanmasına meydan okur. Basit tekrarların geniş bölgeleri hizalamayı daha da karmaşık hale getirebilir. Alternatif olarak, de novo montajların yapısal varyasyonunun ve iskelesinin haritalanması için NGS ile birlikte bir atlama kitaplığı kullanılabilir.
Atlama kitaplıkları, dahil edilen DNA parçalarının uzunluğuna göre kategorize edilebilir.
Kısa atlama kitaplığı
Kısa atlamalı bir kitaplıkta, 3 kb'lik genomik DNA fragmanları, biyotinilat uçlarıyla bağlanır ve daireselleştirilir. Dairesel bölümler daha sonra küçük parçalara bölünür ve biyotinlenmiş parçalar, çift uçlu dizileme için afinite tahlili ile seçilir.
Kısa atlama kitaplıklarıyla ilgili iki sorun vardır. İlk olarak, bir okuma biyotinlenmiş daireselleştirme bağlantısından geçebilir ve etkin okuma uzunluğunu azaltabilir. İkinci olarak, atlanmamış parçalardan (yani, daireselleştirme bağlantısı olmayan parçalar) okumalar sıralanır ve genomik kapsamı azaltır. Atlamayan fragmanların, seçim boyutuna bağlı olarak %4 ila %13 arasında değiştiği bildirilmiştir. İlk problem, daireleri daha büyük bir boyuta keserek çözülebilir ve bu daha büyük parçalar için seçim yapılabilir. İkinci sorun, özel bir barkodlu atlama kitaplığı kullanılarak çözülebilir.
Özel barkodlu atlama kitaplığı
Bu atlama kitaplığı, çoğullama için barkodlarla birlikte parça seçimi için işaretleyiciler içeren adaptörler kullanır. Protokol Talkowski ve ark. ve SOLiD dizilimi için eş-çift kitaplığı hazırlığına dayalıdır. Seçilen DNA parçası boyutu 3.5 – 4.5 kb'dir. İki adaptör dahil edildi: biri EcoP15I tanıma alanı ve bir AC çıkıntısı içeriyor; diğeri bir GT çıkıntısı, biyotinlenmiş bir timin ve bir oligo barkodu içerir. Daireselleştirilmiş DNA sindirildi ve biyotinlenmiş adaptörlere sahip parçalar seçildi (bakınız Şekil 3). EcoP15I tanıma alanı ve barkodu, bağlantı parçalarını atlamayan parçalardan ayırmaya yardımcı olur. Bu hedeflenen parçalar 25 ila 27bp genomik DNA, EcoP15I tanıma bölgesi, çıkıntı ve barkod içermelidir.
Uzun atlama kitaplığı
Bu kitaplık oluşturma süreci, koşulun daha uzun parçalar (5 kb) için optimize edilmesi dışında kısa atlama kitaplığına benzer.
Fosmid atlama kitaplığı
Bu kitaplık oluşturma işlemi, büyük (40 kb) DNA fragmanlarının amplifikasyonu için E. coli vektörü kullanılarak transfeksiyon gerekmesi dışında, kısa atlamalı kitaplığınkine de benzer. Ek olarak, fosmitler , belirli yeni nesil sıralayıcılarla uyumlu atlama kitaplığına dönüştürmeyi kolaylaştırmak için değiştirilebilir.
Eşleştirilmiş son sıralama
Sıçrayan kitaplığın oluşturulması sırasında daireselleştirmeden kaynaklanan parçalar bölünür ve işaretleyicileri olan DNA parçaları zenginleştirilir ve çift uçlu dizilemeye tabi tutulur. Bu DNA parçaları her iki uçtan dizilenir ve okuma çiftleri oluşturur. Her bir çiftteki okumalar arasındaki genomik mesafe yaklaşık olarak bilinir ve montaj işlemi için kullanılır. Örneğin, rastgele parçalanma ile oluşturulan bir DNA klonu yaklaşık 200 bp'dir ve her bir uçtan okuma, birbiriyle örtüşen yaklaşık 180 bp'dir. Bu, temelde yeni nesil dizilemenin atlama kitaplıkları ile bir kombinasyonu olan eş-çift dizilemesinden ayırt edilmelidir.
hesaplamalı analiz
Sıçrayan kitaplık verilerini işlemek için farklı montaj araçları geliştirilmiştir. Bir örnek DELLY'dir. DELLY, genomik yapısal varyantları keşfetmek için geliştirildi ve dizi düzeyinde yeniden düzenlemeleri tespit etmek için "kısa ek çiftli uçları, uzun menzilli eş-çiftleri ve bölünmüş okuma hizalamalarını bütünleştirir".
ALLPATHS-LG montajcısı tarafından yeni deneysel tasarım ve algoritma geliştirmenin ortak gelişimine bir örnek gösterilmiştir.
Onayla
Genetik ve genomik değişikliklerin tespiti için kullanıldığında, atlama klonları Sanger dizilimi ile doğrulama gerektirir .
Uygulamalar
Erken başvurular
İlk günlerde, hastalık genlerini tanımlamak ve klonlamak için genetik olarak bağlantılı DNA markörlerinden yürüyen kromozom kullanıldı. Bununla birlikte, bilinen belirteçler ile ilgilenilen gen arasındaki büyük moleküler mesafe, klonlama sürecini karmaşıklaştırıyordu. 1987'de, kistik fibroz genini klonlamak için bir insan kromozom atlama kütüphanesi oluşturuldu. Kistik fibroz , 2000 Kafkasyalıda 1'i etkileyen otozomal resesif geçişli bir hastalıktır. Bu, atlama kitaplıklarının yararlılığının gösterildiği ilk hastalıktı. Met onkogen, insan kromozom 7 üzerindeki kistik fibroz genine sıkıca bağlı bir işaretçiydi ve kitaplık, bu işaretleyiciden başlayarak bir atlama klonu için tarandı. Kistik fibroz geninin, met geninin 240 kb akış aşağısında lokalize olduğu belirlendi. Kromozom sıçraması, haritalama "adımlarını" azaltmaya yardımcı oldu ve memeli genomundaki oldukça tekrarlayan bölgeleri atladı. Kromozom sıçraması, bu ve diğer hastalıkların daha hızlı teşhisi için gerekli olan probların üretilmesine de izin verdi.
Yeni uygulamalar
Kromozomal yeniden düzenlemeleri karakterize etme
Dengeli kromozomal yeniden düzenlemeler, lösemi çalışmalarının gösterdiği gibi, hastalıklara önemli bir katkı sağlayabilir. Bununla birlikte, birçoğu kromozomal mikrodizi tarafından tespit edilmemiştir. Karyotipleme ve FISH, dengeli translokasyonları ve inversiyonları tanımlayabilir, ancak emek yoğundur ve düşük çözünürlük sağlar (küçük genomik değişiklikler gözden kaçırılır).
Bu tür genomik değişiklikleri tanımlamak için bir atlama kitaplığı NGS birleşik yaklaşımı uygulanabilir. Örneğin, Slade ve ark. Wilms tümörlü bir çocukta de novo dengeli translokasyonun hassas haritasını çıkarmak için bu yöntemi uyguladı . Bu çalışma için 50 milyon okuma üretildi, ancak bunların yalnızca %11,6'sı benzersiz bir şekilde yaklaşık altı kat kapsamı temsil eden referans genomla eşlenebildi.
Talkowski et al. dengeli kromozom değişikliklerini saptamak için farklı yaklaşımları karşılaştırdılar ve yeni nesil DNA dizilimi ile kombinasyon halinde değiştirilmiş atlama kitaplığının kromozomal kırılma noktalarını haritalamak için doğru bir yöntem olduğunu gösterdi. İki çeşit atlama kitaplığı (kısa atlama kitaplıkları ve özel barkodlu atlama kitaplıkları) test edildi ve standart sıralama kitaplıkları ile karşılaştırıldı. Standart NGS için 200-500bp fragmanlar üretilir. Parçaların yaklaşık %0.03-%0.54'ü, iki farklı kromozomla eşlenen son okuma çiftleri olan kimerik çiftleri temsil eder. Bu nedenle, çok az parça kesme noktası alanını kaplar. 3,2–3,8 kb'lik parçalara sahip kısa atlama kitaplıkları kullanıldığında, kimerik çiftlerin yüzdesi %1,3'e yükseldi. Özel Barkodlu Atlama Kitaplıkları ile kimerik çiftlerin yüzdesi daha da artarak %1,49'a yükseldi.
Doğum öncesi tanı
Konvansiyonel sitogenetik testler, bir hamileliğin sonucunu tahmin etmek için gereken gen düzeyinde çözünürlüğü sağlayamaz ve tüm genom derin dizilimi, rutin doğum öncesi tanı için pratik değildir. Tüm genom atlama kütüphanesi, geleneksel doğum öncesi testleri tamamlayabilir. Bu yeni yöntem, bir CHARGE sendromu vakasını belirlemek için başarıyla uygulandı .
Yeni montaj
Gelen metagenomics , suşları arasında paylaşılan genomunun bölgeler tipik olarak daha uzun okur daha vardır. Bu, montaj sürecini karmaşıklaştırır ve bir tür için bireysel genomları yeniden yapılandırmayı göz korkutucu bir görev haline getirir. Genomda birbirinden çok uzakta eşlenen kimerik çiftler, de novo birleştirme sürecini kolaylaştırabilir. Daha uzun atlama kitaplığı kullanarak, Ribeiro ve ark. bakteri genomlarının birleşimlerinin hem maliyeti hem de zamanı azaltırken yüksek kalitede olduğunu gösterdi.
sınırlama
Sıralamanın maliyeti önemli ölçüde düşerken, atlama kitaplıklarının yapım maliyeti düşmedi. Bu nedenle, yeni dizileme teknolojileri ve biyoinformatik araçlar geliştirildikçe, atlama kitaplıkları gereksiz hale gelebilir.
Ayrıca bakınız
Referanslar
Dış bağlantılar
- DELLY: Entegre eşleştirilmiş uç ve bölünmüş okuma analizi ile yapısal varyant keşfi
- ALLPATHS-LG: tam genomlu av tüfeği mikro okumalarının de novo montajı
- ^ Butler, J; MacCallum, ben; Kleber, M; Shlyakhter, IA; Belmonte, MK; Lander, ES; Nusbaum, C; Jaffe, DB (Mayıs 2008). "ALLPATHS: tam genomlu av tüfeği mikro okumalarının de novo montajı" . Genom Araştırması . 18 (5): 810–20. doi : 10.1101/gr.7337908 . PMC 2336810 . PMID 18340039 .