DNA kopyalama - DNA replication

DNA replikasyonu: Çift sarmal "sıkıştırılır" ve çözülür, daha sonra ayrılan her bir iplikçik (turkuaz), yeni bir ortak ipliğin (yeşil) kopyalanması için bir şablon görevi görür. Nükleotidler (bazlar), yeni ortak zincirleri iki yeni çift sarmal halinde sentezlemek için eşleştirilir.

Olarak moleküler biyoloji , DNA replikasyonu olan biyolojik işlem bir orijinal DNA, iki özdeş kopyaları üretme DNA molekülü. DNA replikasyonu, biyolojik kalıtımın en önemli parçası olarak hareket eden tüm canlı organizmalarda meydana gelir . Bu, hasarlı dokuların büyümesi ve onarımı sırasında hücre bölünmesi için gereklidir ve aynı zamanda yeni hücrelerin her birinin kendi DNA kopyasını almasını sağlar . Hücre, DNA'nın replikasyonunu gerekli kılan ayırt edici bölünme özelliğine sahiptir.

DNA oluşur çift sarmal iki tamamlayıcı şerit . Çift sarmal, birbirine zıt çalışan ve birlikte bükülerek oluşan iki doğrusal zincirden oluşan çift sarmallı bir DNA'nın görünümünü tanımlar. Çoğaltma sırasında bu iplikler ayrılır. Orijinal DNA molekülünün her bir ipliği, daha sonra, yarı-koruyucu replikasyon olarak adlandırılan bir süreç olan, muadili üretimi için bir şablon görevi görür . Yarı-koruyucu replikasyonun bir sonucu olarak, yeni sarmal, orijinal bir DNA zincirinin yanı sıra yeni sentezlenmiş bir iplikten oluşacaktır. Hücresel düzeltme ve hata kontrol mekanizmaları , DNA replikasyonu için mükemmele yakın bir aslına uygunluk sağlar.

Bir de hücre , DNA replikasyon belirli yerlerde veya başlar replikasyon kökeni de, genomun bir organizmanın genetik malzeme içerir. DNA'nın orijinde çözülmesi ve helikaz olarak bilinen bir enzim tarafından barındırılan yeni ipliklerin sentezi, orijinden çift ​​yönlü olarak büyüyen replikasyon çatalları ile sonuçlanır . DNA sentezinin başlatılmasına ve sürdürülmesine yardımcı olmak için bir dizi protein replikasyon çatalı ile ilişkilidir . En belirgin şekilde, DNA polimeraz , her bir (şablon) zinciri tamamlayan nükleotidler ekleyerek yeni zincirleri sentezler . DNA replikasyonu interfazın S-evresinde gerçekleşir .

DNA replikasyonu (DNA amplifikasyonu) ayrıca in vitro (yapay olarak, bir hücrenin dışında) gerçekleştirilebilir. Hücrelerden izole edilen DNA polimerazlar ve yapay DNA primerleri, bir şablon DNA molekülünde bilinen dizilerde DNA sentezini başlatmak için kullanılabilir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), ligaz zincir reaksiyonu (LCR) ve transkripsiyon aracılı amplifikasyon (TMA) örneklerdir. Mart 2021'de araştırmacılar , genetik koda uygun olarak yeni proteinlerin biyolojik sentezi olan translasyonun gerekli bir bileşeni olan transfer RNA'nın ön formunun yaşamın çok erken gelişiminde bir kopyalayıcı molekül olabileceğini öne süren kanıtlar bildirdiler . veya abiyogenez .

DNA yapısı

DNA, çift sarmallı bir yapı olarak bulunur ve her iki sarmal da karakteristik çift ​​sarmal oluşturmak üzere birbirine sarılır . Her bir DNA zinciri, dört tip nükleotitten oluşan bir zincirdir . DNA'daki nükleotitler, bir deoksiriboz şeker, bir fosfat ve bir nükleobaz içerir . Dört nükleotit türü , dört nükleobaz adenin , sitozin , guanin ve timine karşılık gelir ve bunlar genellikle A, C, G ve T olarak kısaltılır. Adenin ve guanin pürin bazları iken sitozin ve timin pirimidinlerdir . Bu nükleotidler fosfodiester bağları oluşturarak, nükleobazlar içe dönük (yani karşı zincire doğru) DNA çift sarmalının fosfat-deoksiriboz omurgasını oluşturur. Nükleobazlar, baz çiftlerini oluşturmak için hidrojen bağları yoluyla zincirler arasında eşleştirilir . Adenin timinle (iki hidrojen bağı) ve guanin sitozinle (üç hidrojen bağı ) çiftleşir .

DNA ipliklerinin bir yönlülüğü vardır ve tek bir ipliğin farklı uçlarına "3' (üç-asal) uç" ve "5' (beş-asal) uç" denir. Geleneksel olarak, tek bir DNA zincirinin baz dizisi verilirse, dizinin sol ucu 5' ucu, dizinin sağ ucu ise 3' ucudur. Çift sarmalın iplikleri, biri 5' ila 3' ve zıt iplik 3' ila 5' olmak üzere anti-paraleldir. Bu terimler, zincirdeki bir sonraki fosfatın bağlandığı deoksiribozdaki karbon atomunu ifade eder. Yönlülüğün DNA sentezinde sonuçları vardır, çünkü DNA polimeraz, bir DNA zincirinin 3' ucuna nükleotidler ekleyerek DNA'yı yalnızca bir yönde sentezleyebilir.

DNA'daki tamamlayıcı bazların eşleşmesi ( hidrojen bağı yoluyla ), her bir zincirde bulunan bilgilerin gereksiz olduğu anlamına gelir. Fosfodiester (iplik içi) bağları, hidrojen (iplik arası) bağlarından daha güçlüdür. Fosfodiester bağlarının asıl işi, DNA polimerlerinin bir nükleotidin 5' karbonunu başka bir nükleotidin 3' karbonuna bağladığı, hidrojen bağlarının ise DNA çift sarmallarını sarmal ekseni boyunca stabilize ettiği ancak eksen 1 yönünde olmadığı yerdir. .Bu, tellerin birbirinden ayrılmasını sağlar. Tek bir zincir üzerindeki nükleotitler, bu nedenle, yeni sentezlenmiş bir ortak zincir üzerindeki nükleotitleri yeniden yapılandırmak için kullanılabilir.

DNA polimeraz

DNA polimerazlar, bir DNA zincirinin 3' ucuna nükleotidler ekler. Yanlışlıkla bir uyumsuzluk dahil edilirse, polimerazın daha fazla uzaması engellenir. Düzeltme okuması, eşleşmeyen nükleotidi ortadan kaldırır ve uzama devam eder.

DNA polimerazlar , her türlü DNA replikasyonunu gerçekleştiren bir enzim ailesidir . DNA polimerazlar genel olarak yeni ipliklerin sentezini başlatamazlar, ancak yalnızca bir şablon iplikle eşleştirilmiş mevcut bir DNA veya RNA ipliğini uzatabilir. Senteze başlamak için, primer olarak adlandırılan kısa bir RNA parçası oluşturulmalı ve şablon DNA zinciri ile eşleştirilmelidir.

DNA polimeraz, mevcut bir nükleotid zincirinin 3' ucunu uzatarak yeni bir DNA zinciri ekler , fosfodiester bağlarının oluşturulması yoluyla birer birer şablon iplikle eşleşen yeni nükleotitler ekler . Bu DNA polimerizasyonu süreci için enerji, birleşmemiş her bir baza bağlı üç fosfat arasındaki yüksek enerjili fosfat (fosfoanhidrit) bağlarının hidrolizinden gelir . Bağlı fosfat gruplarıyla birlikte serbest bazlara nükleotidler denir ; özellikle, bağlı üç fosfat grubuna sahip bazlara nükleosit trifosfatlar denir . Büyüyen bir DNA zincirine bir nükleotit eklendiğinde, nükleotidin proksimal fosfatı ile büyüyen zincir arasında bir fosfodiester bağının oluşumuna, yüksek enerjili bir fosfat bağının hidrolizi ve iki distal fosfatın bir pirofosfat olarak salınması eşlik eder. . Elde edilen pirofosfatın inorganik fosfata enzimatik hidrolizi, ikinci bir yüksek enerjili fosfat bağı tüketir ve reaksiyonu etkili bir şekilde geri döndürülemez hale getirir.

Genel olarak, DNA polimerazları, her 10 için en az bir hata bir iç hata oranı, son derece hassas olan 7 ilave nükleotidler. Ek olarak, bazı DNA polimerazlar da düzeltme okuma yeteneğine sahiptir; uyumsuz bazları düzeltmek için büyüyen bir ipliğin ucundan nükleotitleri çıkarabilirler. Son olarak, replikasyon sonrası uyumsuzluk onarım mekanizmaları, yeni sentezlenmiş DNA dizisindeki uyumsuzlukları orijinal dizi dizisinden ayırt edebilen DNA'yı hatalar için izler. Birlikte, bu üç ayrım adımları her 10 için en az bir hata çoğaltma aslına olanak 9 ilave nükleotidler.

Canlı bir hücrede DNA replikasyonu hızı, ilk olarak faj ile enfekte olmuş E. coli'de faj T4 DNA uzama hızı olarak ölçülmüştür . 37 °C'de üstel DNA artışı periyodu sırasında, oran saniyede 749 nükleotitti. Faj T4 DNA sentezi sırasında kopyalama için baz çifti başına mutasyon oranı, 10 için 1.7 olan 8 .

çoğaltma işlemi

DNA replikasyonundaki adımlara genel bakış
DNA sentezindeki adımlar

DNA replikasyonu, tüm biyolojik polimerizasyon süreçleri gibi, enzimatik olarak katalizlenen ve koordine edilen üç adımda ilerler: başlatma, uzama ve sonlandırma.

başlatma

DNA replikasyonunun başlatılması için başlatıcıların rolü.
Ön çoğaltma kompleksinin oluşumu.

Bir hücrenin bölünebilmesi için önce kendi DNA'sını kopyalaması gerekir. DNA replikasyonu ya hep ya hiç sürecidir; replikasyon başladığında, tamamlanmaya devam eder. Replikasyon tamamlandıktan sonra aynı hücre döngüsünde tekrar oluşmaz. Bu, çoğaltma öncesi kompleksin başlatılmasının bölünmesiyle mümkün olur .

Ön çoğaltma kompleksi

Geç mitoz ve erken G1 evresinde , büyük bir başlatıcı protein kompleksi, DNA'nın " kökenler " olarak bilinen belirli noktalarında replikasyon öncesi kompleksinde toplanır . Olarak , E. coli , birincil başlatıcı proteinidir DnaA ; içinde maya , bu kökenli tanıma kompleksi . Başlatıcı proteinler tarafından kullanılan diziler "AT bakımından zengin" olma eğilimindedir (adenin ve timin bazları bakımından zengin), çünkü AT baz çiftleri iki hidrojen bağına sahiptir (bir CG çiftinde oluşturulan üçten ziyade) ve bu nedenle zincirden ayrılmak daha kolaydır. Ökaryotlarda, orijin tanıma kompleksi, başlatıcı proteinlerin replikasyon öncesi kompleksine birleştirilmesini katalize eder. Cdc6 ve Cdt1 daha sonra Mcm kompleksini DNA'ya yüklemek için gerekli olan daha büyük bir kompleks oluşturmak için orijindeki bağlı orijin tanıma kompleksi ile birleşir . Mcm kompleksi, ökaryotlarda replikasyon orijinlerinde ve replikasyon çatallarında DNA sarmalını çözecek olan helikazdır. Mcm kompleksi, geç G1 fazında toplanır ve ORC-Cdc6-Cdt1 kompleksi tarafından ATP'ye bağlı protein yeniden şekillenmesi yoluyla DNA'ya yüklenir. Mcm kompleksinin orijin DNA'sına yüklenmesi, replikasyon öncesi kompleks oluşumunun tamamlandığını gösterir.

Geç G1 fazında çevresel koşullar uygunsa , DNA sentetik makinesinin bileşenlerini kodlayan genlerin ekspresyonunu uyaran G1 ve G1/S siklin - Cdk kompleksleri aktive edilir. G1/S-Cdk aktivasyonu ayrıca türlere ve hücre tipine bağlı olarak replikasyon kökenlerinin aktivasyonunda rol oynayabilen S-Cdk komplekslerinin ekspresyonunu ve aktivasyonunu da destekler. Bu Cdk'lerin kontrolü, hücre tipine ve gelişme aşamasına bağlı olarak değişir. Bu düzenleme en iyi , S siklinleri Clb5 ve Clb6'nın DNA replikasyonundan birincil olarak sorumlu olduğu tomurcuklanan mayalarda anlaşılır . Clb5,6-Cdk1 kompleksleri, replikasyon orijinlerinin aktivasyonunu doğrudan tetikler ve bu nedenle, her bir orijini doğrudan aktive etmek için S fazı boyunca gereklidir.

Benzer bir şekilde, replikasyon orijinlerini etkinleştirmek için S fazı boyunca Cdc7 de gereklidir . Cdc7 hücre döngüsü boyunca aktif değildir ve aktivasyonu, DNA replikasyonunun erken başlamasını önlemek için kesinlikle zamanlanmıştır. Geç Gl'de , Cdc7'yi doğrudan bağlayan ve protein kinaz aktivitesini destekleyen düzenleyici alt birim Dbf4 ile birleşmenin bir sonucu olarak Cdc7 aktivitesi aniden yükselir . Cdc7'nin orijin aktivitesinin hız sınırlayıcı bir düzenleyicisi olduğu bulunmuştur. Birlikte, G1/S-Cdks ve/veya S-Cdks ve Cdc7, replikasyon kökenlerini doğrudan aktive etmek için işbirliği yaparak DNA sentezinin başlatılmasına yol açar.

ön başlatma kompleksi

Erken S fazında, S-Cdk ve Cdc7 aktivasyonu, orijinde oluşan büyük bir protein kompleksi olan ön-başlatma kompleksinin bir araya gelmesine yol açar. Ön-başlatma kompleksinin oluşumu, Cdc6 ve Cdt1'i orijin replikasyon kompleksinden uzaklaştırır, pre-replikasyon kompleksini etkisiz hale getirir ve söker. Başlangıç ​​kompleksinin orijine yüklenmesi, Mcm sarmalını aktive ederek DNA sarmalının çözülmesine neden olur. Ön başlatma kompleksi ayrıca α-primaz ve diğer DNA polimerazlarını DNA'ya yükler .

α-primaz ilk primerleri sentezledikten sonra, primer-şablon bağlantıları, DNA sentezini başlatmak için kayan kelepçeyi DNA'ya yükleyen kelepçe yükleyici ile etkileşime girer. Başlangıç ​​öncesi kompleksin bileşenleri, orijinden çıktıkça çoğaltma çatallarıyla ilişkili kalır.

Uzama

DNA polimeraz 5′–3′ aktiviteye sahiptir. Bilinen tüm DNA replikasyon sistemleri, sentez başlatılmadan önce serbest bir 3' hidroksil grubu gerektirir (not: DNA şablonu 3' ila 5' yönünde okunurken, yeni bir iplik 5' ila 3' yönünde sentezlenir - bu genellikle Şaşkın). DNA sentezi için dört farklı mekanizma tanınır:

  1. Tüm hücresel yaşam formları ve birçok DNA virüsü , fajlar ve plazmitler , daha sonra bir DNA polimeraz tarafından uzatılan serbest 3' OH grubuna sahip kısa bir RNA primerini sentezlemek için bir primaz kullanır .
  2. Retroelementler ( retrovirüsler dahil ), ters transkriptaz tarafından uzama için kullanılan serbest bir 3′ OH sağlayarak DNA replikasyonunu hazırlayan bir transfer RNA kullanır .
  3. Gelen adenovirüsler ve φ29 etti bakteriyofajlar , 3 'OH grubu nükleotit yeni çilesine DNA polimerazı ile eklendiği genom bağlı proteinine ait bir amino asit yan zincir (terminal protein) tarafından sağlanır.
  4. İçeren tek zincirli DNA olarak virüs-grup sirkovirüsler , geminivirüslerin , parvovirüsleri ve diğerleri-ve aynı zamanda birçok fajlar ve plazmidler (RCR) mekanizması yuvarlanan çember çoğaltma kullanmak RCR endonükleaz genom ipliğindeki bir çentik oluşturur (tek zincirli virüsler) veya DNA dizilerinden biri (plazmitler). Çentikli ipliğin 5' ucu , nükleaz üzerindeki bir tirozin tortusuna aktarılır ve daha sonra serbest 3' OH grubu, yeni zinciri sentezlemek için DNA polimeraz tarafından kullanılır.

Birincisi bu mekanizmalardan en iyi bilinenidir ve hücresel organizmalar tarafından kullanılır. Bu mekanizmada, iki iplik ayrıldığında, primaz , şablon ipliklere RNA primerleri ekler. Öncü iplikçik bir RNA primeri alırken, geride kalan iplikçik birkaç tane alır. Öncü iplikçik, yüksek işlenebilirliğe sahip bir DNA polimeraz tarafından primerden sürekli olarak uzatılırken , gecikmeli iplik, Okazaki fragmanlarını oluşturan her bir primerden süreksiz olarak uzatılır . RNaz , primer RNA parçalarını uzaklaştırır ve replikatif polimerazdan farklı, düşük işlenebilirlikli bir DNA polimeraz, boşlukları doldurmak için girer. Bu tamamlandığında, önde gelen iplikte tek bir çentik ve gecikmeli iplikte birkaç çentik bulunabilir. Ligaz , bu çentikleri doldurmak için çalışır, böylece yeni kopyalanmış DNA molekülünü tamamlar.

Bu süreçte kullanılan primaz, bakteri ve arke / ökaryotlar arasında önemli ölçüde farklılık gösterir . Bakteriler , TOPRIM kat tipinin bir katalitik alanını içeren DnaG protein süper ailesine ait bir primaz kullanır . TOPRIM kıvrımı, Rossmann benzeri bir topolojide dört korunmuş şeride sahip bir α/β çekirdeği içerir . Bu yapı aynı zamanda topoizomeraz la, topoizomeraz II, OLD-ailesi nükleazları ve RecR proteini ile ilgili DNA onarım proteinlerinin katalitik alanlarında da bulunur .

Arkeler ve ökaryotlar tarafından kullanılan primaz, aksine, RNA tanıma motifinin (RRM) yüksek oranda türetilmiş bir versiyonunu içerir . Bu primaz, DNA replikasyonu ve onarımında yer alan A/B/Y ailelerinin birçok viral RNA-bağımlı RNA polimerazına, ters transkriptazına, siklik nükleotid üreten siklazına ve DNA polimerazına yapısal olarak benzerdir. Ökaryotik replikasyonda primaz, Pol α ile bir kompleks oluşturur.

Çoklu DNA polimerazları, DNA replikasyon sürecinde farklı roller üstlenir. Olarak , E. coli , DNA pol III DNA replikasyonu için başlıca sorumlu polimeraz enzimdir. Tüm çoğaltma döngüsü boyunca bozulmadan kalan, son derece yüksek bir işlenebilirlik sergileyen çoğaltma çatalında bir çoğaltma kompleksi halinde toplanır. Buna karşılık, DNA Pol I , RNA primerlerini DNA ile değiştirmekten sorumlu enzimdir. DNA Pol I, polimeraz aktivitesine ek olarak 5' ila 3' eksonükleaz aktivitesine sahiptir ve eksonükleaz aktivitesini, nick translasyonu adı verilen bir işlemde, arkasındaki DNA zincirini uzatırken önündeki RNA primerlerini bozmak için kullanır . Pol I, Pol III'ten çok daha az işlemseldir çünkü DNA replikasyonundaki birincil işlevi birkaç çok uzun bölge yerine birçok kısa DNA bölgesi yaratmaktır.

Gelen ökaryotlarda bu primaz ile bir kompleks oluşturan, çünkü, düşük işlenebilme enzim Pol α, çoğaltması başlatmak için yardımcı olur. Ökaryotlarda, önde gelen iplik sentezinin Pol ε tarafından yürütüldüğü düşünülmektedir; ancak, bu görüşe son zamanlarda itiraz edildi ve Pol δ için bir rol önerildi. Primer çıkarılması Pol δ ile, DNA'nın replikasyon sırasında onarımı Pol ε ile tamamlanır.

DNA sentezi devam ederken, orijinal DNA iplikleri balonun her iki tarafında gevşemeye devam eder ve iki uçlu bir replikasyon çatalı oluşturur . Dairesel kromozomlarında tek bir replikasyon kaynağı olan bakterilerde bu süreç bir " teta yapısı " oluşturur (Yunanca teta harfine benzer: θ). Buna karşılık, ökaryotlar daha uzun lineer kromozomlara sahiptir ve bunlar içinde çoklu kökenlerde replikasyon başlatır.

çoğaltma çatalı

Çoğaltma çatalının şeması.
a: şablon, b: öncü dizi, c: gecikmeli dizi, d: çoğaltma çatalı, e: astar, f: Okazaki parçaları
DNA replikasyon çatalında birçok enzim yer alır.

Replikasyon çatalı, DNA replikasyonu sırasında uzun sarmal DNA içinde oluşan bir yapıdır. İki DNA zincirini sarmalda bir arada tutan hidrojen bağlarını kıran sarmallar tarafından oluşturulur. Ortaya çıkan yapı, her biri tek bir DNA dizisinden oluşan iki dallı "uç"a sahiptir. Bu iki zincir, DNA polimeraz tamamlayıcı nükleotidleri şablonlarla eşleştirirken oluşturulacak olan öncü ve gecikmeli zincirler için şablon görevi görür; şablonlar, uygun şekilde önde gelen iplik şablonu ve gecikmeli iplik şablonu olarak adlandırılabilir.

DNA, DNA polimeraz tarafından 3' ila 5' yönünde okunur, yani yeni iplik 5' ila 3' yönünde sentezlenir. Önde gelen ve gecikmeli iplik şablonları, replikasyon çatalında zıt yönlerde yönlendirildiğinden, önemli bir sorun, sentez yönü büyüyen replikasyon çatalının yönünün tersi olan yeni gecikmeli iplik DNA'sının sentezinin nasıl sağlanacağıdır.

önde gelen iplik

Önde gelen zincir, büyüyen replikasyon çatalıyla aynı yönde sentezlenen yeni DNA zinciridir. Bu tür DNA replikasyonu süreklidir.

gecikmeli iplik

Gecikmeli iplik, sentez yönü büyüyen replikasyon çatalının yönüne zıt olan yeni DNA ipliğidir. Yönünden dolayı, gecikmeli ipliğin replikasyonu, önde gelen diziye kıyasla daha karmaşıktır. Sonuç olarak, bu iplikteki DNA polimerazın diğer ipliğin "gerisinde kaldığı" görülür.

Gecikmeli iplik, kısa, ayrılmış segmentlerde sentezlenir. Gecikmeli iplik şablonunda , bir primaz , şablon DNA'yı "okur" ve kısa bir tamamlayıcı RNA primerinin sentezini başlatır . Bir DNA polimeraz, hazırlanmış segmentleri uzatarak Okazaki fragmanlarını oluşturur . RNA primerleri daha sonra çıkarılır ve DNA ile değiştirilir ve DNA fragmanları DNA ligaz ile birleştirilir .

Çoğaltma çatalındaki dinamikler

PCNA proteininin bir trimeri olan birleştirilmiş insan DNA kelepçesi .

Her durumda sarmal, kopyalanan DNA'nın yalnızca bir sarmalının etrafını saran altı polipeptitten oluşur. İki polimeraz helikaz heksimere bağlıdır. Ökaryotlarda sarmal öncü ipliğin etrafına sarılır ve prokaryotlarda gecikmeli ipliğin etrafına sarılır.

Helikaz DNA'yı replikasyon çatalında çözerken, öndeki DNA dönmeye zorlanır. Bu süreç, ilerideki DNA'da bir bükülme oluşmasına neden olur. Bu birikim, sonunda çoğaltma çatalının ilerlemesini durduracak bir burulma direnci oluşturur. Topoizomerazlar, DNA sarmalının iki sarmalının çözülmesinin neden olduğu gerilimi hafifleterek, DNA sarmallarını geçici olarak kıran enzimlerdir; topoizomerazlar ( DNA giraz dahil ), bunu DNA sarmalına negatif süper sarmallar ekleyerek başarır .

Çıplak tek sarmallı DNA, ikincil yapılar oluşturarak kendi üzerine katlanma eğilimindedir ; bu yapılar DNA polimerazın hareketine müdahale edebilir. Bunu önlemek için tek zincirli bağlayıcı proteinler , ikinci bir zincir sentezlenene kadar DNA'ya bağlanır ve ikincil yapı oluşumunu engeller.

Çift iplikli DNA, gen ekspresyonunun düzenlenmesinde önemli bir rol oynayan histonların etrafına sarılır, bu nedenle çoğaltılan DNA, orijinal DNA ile aynı yerlerde histonların etrafına sarılmalıdır. Bunu sağlamak için histon şaperonları , kopyalanmadan önce kromatini parçalarına ayırır ve histonları doğru yerde değiştirir. Bu yeniden birleştirmedeki bazı adımlar biraz spekülatiftir.

Kelepçe proteinleri , DNA çevresinde kayan bir kelepçe oluşturarak DNA polimerazın şablonuyla teması sürdürmesine yardımcı olur ve böylece işlemeye yardımcı olur. Kelepçenin iç yüzü, DNA'nın içinden geçmesini sağlar. Polimeraz şablonun sonuna ulaştığında veya çift sarmallı DNA'yı tespit ettiğinde, kayan kelepçe, DNA polimerazı serbest bırakan bir konformasyonel değişime uğrar. Kelepçe yükleme proteinleri, şablon ve RNA primerleri arasındaki bağlantıyı tanıyarak, başlangıçta kelepçeyi yüklemek için kullanılır. :274-5

DNA replikasyon proteinleri

Replikasyon çatalında, birçok replikasyon enzimi, DNA üzerinde replisom adı verilen karmaşık bir moleküler makinede birleşir . Aşağıdakiler, replizoma katılan başlıca DNA replikasyon enzimlerinin bir listesidir:

Enzim DNA replikasyonundaki işlev
DNA sarmalı Sarmal destabilize edici enzim olarak da bilinir. Helikaz , topoizomerazın arkasındaki Replikasyon Çatalındaki iki DNA zincirini ayırır .
DNA polimeraz DNA replikasyonu sırasında 5' ila 3' yönünde nükleotit substratlarının DNA'ya eklenmesini katalize etmekten sorumlu enzim. Ayrıca prova okuması ve hata düzeltmesi yapar. Her biri farklı hücre tiplerinde farklı işlevler gerçekleştiren birçok farklı DNA Polimeraz türü vardır.
DNA kelepçesi Uzayan DNA polimerazlarının DNA ana zincirinden ayrılmasını önleyen bir protein.
Tek zincirli DNA bağlayıcı protein ssDNA'ya bağlanın ve DNA sarmalının çözülmesinden sonra DNA çift sarmalının yeniden tavlanmasını önleyin, böylece iplik ayrılmasını koruyun ve yeni ipliğin sentezini kolaylaştırın.
topoizomeraz DNA'yı süper sarmal yapısından kurtarır.
DNA giraz DNA helikaz tarafından çözülme gerginliğini hafifletir; bu belirli bir topoizomeraz türüdür
DNA ligazı Yarı muhafazakar iplikleri yeniden tavlar ve gecikmeli ipliğin Okazaki Fragmanlarını birleştirir .
primaz Yeni DNA zincirinin sentezine başlamak için DNA polimeraz için bir RNA (veya DNA) başlangıç ​​noktası sağlar.
telomeraz Ökaryotik kromozomların uçlarına tekrarlayan nükleotid dizileri ekleyerek telomerik DNA'yı uzatır . Bu, germ hücrelerinin ve kök hücrelerin hücre bölünmesindeki Hayflick sınırından kaçınmasını sağlar .

çoğaltma makineleri

E. coli Replizomu. Özellikle, gecikmeli iplik üzerindeki DNA bir ilmek oluşturur. Replizomun tam yapısı iyi anlaşılmamıştır.

Replikasyon makineleri , DNA replikasyonunda yer alan ve şablon ssDNA'larda görünen faktörlerden oluşur. Çoğaltma makineleri şunları içerir: primomotorlar, replikasyon enzimleridir; DNA polimeraz, DNA helikazları, DNA kelepçeleri ve DNA topoizomerazları ve replikasyon proteinleri; örneğin tek sarmallı DNA bağlayıcı proteinler (SSB). Çoğaltma makinelerinde bu bileşenler koordine edilir. Bakterilerin çoğunda, DNA replikasyonunda yer alan faktörlerin tümü replikasyon çatallarında bulunur ve DNA replikasyonu sırasında kompleksler çatallarda kalır. Bu replikasyon makinelerine replisomlar veya DNA replikaz sistemleri denir . Bu terimler, replikasyon çatallarında bulunan proteinler için genel terimlerdir. Ökaryotik ve bazı bakteri hücrelerinde replizomlar oluşmaz.

Replikasyon makineleri, fabrikalar gibi şablon DNA'lara göreli olarak hareket etmedikleri için, replikasyon fabrikası olarak adlandırılırlar . Alternatif bir şekilde, DNA fabrikaları projektörlere benzer ve DNA'lar, projektörlerden sürekli geçen sinematik filmler gibidir. Replikasyon fabrikası modelinde, hem önde gelen iplikler için hem de gecikmeli iplikler için DNA sarmalları şablon DNA'lara yüklendikten sonra, sarmallar DNA'lar boyunca birbirine doğru ilerler. Helikazlar, çoğaltma işleminin geri kalanı için ilişkili kalır. Peter Meister et al. yeşil floresan protein (GFP) etiketli DNA polimerazları α'yı izleyerek tomurcuklanan mayada doğrudan replikasyon bölgeleri gözlemlendi . Bir replikasyon orijininden simetrik olarak aralıklı etiketlenmiş lokus çiftlerinin DNA replikasyonunu saptadılar ve çiftler arasındaki mesafenin zamanla belirgin şekilde azaldığını buldular. Bu bulgu, DNA replikasyon mekanizmasının DNA fabrikaları ile birlikte gittiğini göstermektedir. Yani, çoğaltma fabrikalarının çiftleri, çoğaltma kaynaklarına ve birbirleriyle ilişkili fabrikalara yüklenir. Ayrıca şablon DNA'lar, şablon ssDNA'ların ve yeni DNA'ların ekstrüzyonunu getiren fabrikalara taşınır. Meister'in bulgusu, çoğaltma fabrikası modelinin ilk doğrudan kanıtıdır. Daha sonraki araştırmalar, DNA helikazlarının birçok ökaryotik hücrede dimerler oluşturduğunu ve bakteriyel replikasyon makinelerinin DNA sentezi sırasında tek intranükleer konumda kaldığını göstermiştir.

Çoğaltma fabrikaları, kardeş kromatitlerin çözülmesini gerçekleştirir. Çözülme, DNA replikasyonundan sonra kromatitlerin yavru hücrelere dağıtılması için esastır. Kardeş kromatitler, DNA replikasyonundan sonra birbirlerini Cohesin halkaları ile tuttukları için, DNA replikasyonunda çözülme için tek şans vardır. Replikasyon makinelerinin replikasyon fabrikaları olarak sabitlenmesi, DNA replikasyonunun başarı oranını artırabilir. Replikasyon çatalları kromozomlarda serbestçe hareket ederse, çekirdeklerin katenasyonu şiddetlenir ve mitotik ayrışmayı engeller.

Sonlandırma

Ökaryotlar, DNA replikasyonunu kromozomdaki birçok noktada başlatır, bu nedenle replikasyon çatalları kromozomdaki birçok noktada buluşur ve sona erer. Ökaryotlar lineer kromozomlara sahip olduklarından, DNA replikasyonu kromozomların en sonuna ulaşamaz. Bu problem nedeniyle, kromozomun sonundan itibaren her replikasyon döngüsünde DNA kaybolur. Telomerler , uçlara yakın tekrarlayan DNA bölgeleridir ve bu kısalma nedeniyle gen kaybını önlemeye yardımcı olur. Telomerlerin kısalması somatik hücrelerde normal bir süreçtir . Bu, kızı DNA kromozomunun telomerlerini kısaltır. Sonuç olarak, DNA kaybı daha fazla bölünmeyi engellemeden önce hücreler yalnızca belirli sayıda bölünebilir. (Bu, Hayflick limiti olarak bilinir .) DNA'yı bir sonraki nesle geçiren germ hücre hattı içinde , telomeraz , bozulmayı önlemek için telomer bölgesinin tekrarlayan dizilerini uzatır. Telomeraz, somatik hücrelerde yanlışlıkla aktif hale gelebilir ve bazen kanser oluşumuna yol açabilir . Artan telomeraz aktivitesi, kanserin ayırt edici özelliklerinden biridir.

Sonlandırma, DNA replikasyon çatalının ilerlemesinin durdurulmasını veya bloke edilmesini gerektirir. Spesifik bir lokusta sonlanma meydana geldiğinde, iki bileşen arasındaki etkileşimi içerir: (1) DNA'daki bir sonlandırma bölgesi dizisi ve (2) DNA replikasyonunu fiziksel olarak durdurmak için bu diziye bağlanan bir protein. Çeşitli bakteri türlerinde bu, DNA replikasyonu terminus site bağlama proteini veya Ter proteini olarak adlandırılır .

Bakteriler dairesel kromozomlara sahip olduklarından, iki replikasyon çatalı ebeveyn kromozomunun karşı ucunda buluştuğunda replikasyon sona erer. E. coli , bu işlemi, Tus proteini tarafından bağlandığında , replikasyon çatalının yalnızca bir yönünün geçmesine izin veren sonlandırma dizilerinin kullanımı yoluyla düzenler . Sonuç olarak, çoğaltma çatalları her zaman kromozomun sonlandırma bölgesi içinde buluşmak üzere kısıtlanır.

Düzenleme

Ökaryotik hücrelerin hücre döngüsü.

ökaryotlar

Ökaryotlarda, DNA replikasyonu hücre döngüsü bağlamında kontrol edilir . Hücre büyüyüp bölündükçe hücre döngüsündeki aşamalardan geçer; DNA replikasyonu S fazı (sentez fazı) sırasında gerçekleşir. Ökaryotik hücrenin döngü boyunca ilerlemesi, hücre döngüsü kontrol noktaları tarafından kontrol edilir . Kontrol noktaları yoluyla ilerleme, siklinler ve sikline bağımlı kinazlar dahil olmak üzere çeşitli proteinler arasındaki karmaşık etkileşimler yoluyla kontrol edilir . Bakterilerin aksine, ökaryotik DNA, çekirdeğin sınırları içinde çoğalır.

G1/S kontrol noktası (veya kısıtlama kontrol noktası), ökaryotik hücrelerin DNA replikasyonu ve ardından bölünme sürecine girip girmediğini düzenler. Bu kontrol noktasından geçmeyen hücreler G0 aşamasında kalır ve DNA'larını kopyalamazlar.

G1/S kontrol noktasından geçtikten sonra, DNA her hücre döngüsünde yalnızca bir kez kopyalanmalıdır. Mcm kompleksi orijinden uzaklaştığında, replikasyon öncesi kompleksi dağılır. Yeni bir Mcm kompleksi, replikasyon öncesi alt birimler yeniden etkinleştirilene kadar bir orijine yüklenemediğinden, bir replikasyon orijini aynı hücre döngüsünde iki kez kullanılamaz.

S-Cdk'lerin erken S fazında aktivasyonu, bireysel replikasyon öncesi kompleks bileşenlerin yok edilmesini veya inhibisyonunu teşvik ederek, anında yeniden birleştirmeyi önler. S ve M-Cdks, S aşaması tamamlandıktan sonra bile çoğaltma öncesi karmaşık derlemeyi engellemeye devam ederek, geç mitozda tüm Cdk etkinliği azalana kadar derlemenin tekrar gerçekleşmemesini sağlar.

Tomurcuklanan mayada, birleşmenin inhibisyonu, replikasyon öncesi kompleks bileşenlerin Cdk'ye bağlı fosforilasyonundan kaynaklanır. S fazının başlangıcında, Cdc6'nın Cdk1 tarafından fosforilasyonu, Cdc6'nın SCF ubiquitin protein ligazına bağlanmasına neden olur, bu da Cdc6'nın proteolitik yıkımına neden olur. Mcm proteinlerinin Cdk'ye bağlı fosforilasyonu, S fazı sırasında Cdt1 ile birlikte çekirdekten dışa aktarılmalarını teşvik ederek, tek bir hücre döngüsü sırasında kökenlerde yeni Mcm komplekslerinin yüklenmesini önler. Orijin replikasyon kompleksinin Cdk fosforilasyonu ayrıca replikasyon öncesi kompleks montajını da engeller. Bu üç mekanizmadan herhangi birinin bireysel varlığı, replikasyon öncesi karmaşık montajı engellemek için yeterlidir. Bununla birlikte, aynı hücredeki üç proteinin tümünün mutasyonları, bir hücre döngüsü içinde birçok replikasyon kaynağında yeniden başlatmayı tetikler.

Hayvan hücrelerinde, geminin proteini , replikasyon öncesi kompleks montajının önemli bir inhibitörüdür. Geminin, Cdt1'i bağlar ve orijin tanıma kompleksine bağlanmasını önler. G1'de geminin seviyeleri, geminin'i parçalanma için hedeflemek üzere her yerde bulunan APC tarafından düşük tutulur. Geminin yok edildiğinde, Cdt1 salınır ve replikasyon öncesi kompleks derlemede çalışmasına izin verir. G1'in sonunda APC inaktive olur ve geminin'in Cdt1'i biriktirmesine ve bağlamasına izin verir.

Kloroplast ve mitokondriyal genomların replikasyonu , D-loop replikasyonu süreci boyunca hücre döngüsünden bağımsız olarak gerçekleşir .

çoğaltma odağı

Omurgalı hücrelerinde, replikasyon bölgeleri, replikasyon odakları adı verilen pozisyonlarda yoğunlaşır . Replikasyon bölgeleri, yavru iplikler ve replikasyon enzimlerinin immüno-lekelenmesi ve GFP etiketli replikasyon faktörlerinin izlenmesi ile tespit edilebilir. Bu yöntemlerle, hücre bölünmesinin S fazında değişen büyüklük ve konumlardaki replikasyon odaklarının ortaya çıktığı ve çekirdek başına sayılarının, genomik replikasyon çatallarının sayısından çok daha küçük olduğu bulunmuştur.

P. Heun ve ark. (2001), tomurcuklanan maya hücrelerinde GFP etiketli replikasyon odaklarını izlemiş ve replikasyon orijinlerinin G1 ve S fazında sürekli hareket ettiğini ve dinamiklerin S fazında önemli ölçüde azaldığını ortaya koymuştur . Geleneksel olarak, replikasyon bölgeleri, nükleer matris veya laminler tarafından kromozomların uzamsal yapısı üzerinde sabitlendi . Heun'un sonuçları geleneksel kavramları reddetmiştir, tomurcuklanan mayaların tabakaları yoktur ve replikasyon kökenlerinin kendi kendine birleştiğini ve replikasyon odakları oluşturduğunu desteklemektedir.

Uzamsal ve zamansal olarak kontrol edilen çoğaltma kökenlerinin ateşlenmesiyle, çoğaltma odaklarının oluşumu düzenlenir. DA Jackson ve diğerleri (1998), komşu kökenlerin memeli hücrelerinde aynı anda ateşlendiğini ortaya çıkardı. Çoğaltma sitelerinin uzamsal yan yana yerleştirilmesi, çoğaltma çatallarının kümelenmesini sağlar . Kümeleme , durmuş çoğaltma çatallarını kurtarır ve çoğaltma çatallarının normal ilerlemesini destekler. Çoğaltma çatallarının ilerlemesi birçok faktör tarafından engellenir; proteinlerle veya DNA'ya güçlü bağlanan komplekslerle çarpışma, dNTP'lerin eksikliği, şablon DNA'lardaki çentikler vb. Çoğaltma çatalları durursa ve durdurulan çatallardan kalan diziler kopyalanmazsa, kız iplikler kopyalanmamış siteler elde etmiş olur. Bir ebeveynin sarmalındaki kopyalanmamış bölgeler diğer sarmalı bir arada tutar, ancak yavru sarmalları tutmaz. Bu nedenle ortaya çıkan kardeş kromatitler birbirinden ayrılamaz ve 2 yavru hücreye bölünemez. Komşu orijinler ateşlendiğinde ve bir orijinden çatal durduğunda, diğer orijinden çatal, durmuş çatalın ters yönünde erişin ve kopyalanmamış siteleri çoğaltın. Kurtarmanın diğer mekanizması olarak, normal DNA replikasyonunda fazla kökenlerin tetiklenmediği uykuda replikasyon kökenlerinin uygulanması vardır .

bakteri

Baraj, replikasyondan sonra GATC bölgelerinin adenini metiller.

Çoğu bakteri, iyi tanımlanmış bir hücre döngüsünden geçmez, bunun yerine sürekli olarak DNA'larını kopyalar; hızlı büyüme sırasında bu, birden çok replikasyon turunun eşzamanlı olarak ortaya çıkmasına neden olabilir. Olarak , E. coli hemimethylation ve kompleks yapıcı kökenli dizisinin, oranı: En iyi karakterize edilmiş bakteriler, DNA replikasyonu da dahil olmak üzere, çeşitli mekanizmalarla düzenlenir adenozin trifosfat (ATP) için adenosin difosfat (ADP) ve protein düzeyleri DNAA. Bütün bunlar, başlatıcı proteinlerin orijin dizilerine bağlanmasını kontrol eder.

Çünkü , E. coli metilaz GAİK DNA dizileri, hemimetilatlı dizileri DNA sentezi sonuçları. Bu hemimetillenmiş DNA, orijin sekansını bağlayan ve sekestre eden SeqA proteini tarafından tanınır ; ek olarak, DnaA (replikasyonun başlatılması için gereklidir) hemimetillenmiş DNA'ya daha az bağlanır. Sonuç olarak, yeni kopyalanmış kökenlerin, başka bir DNA replikasyonu turunu hemen başlatması engellenir.

ATP, hücre zengin bir ortamdayken oluşur ve hücre belirli bir boyuta ulaştığında DNA replikasyonunu tetikler. ATP, DnaA'ya bağlanmak için ADP ile rekabet eder ve DnaA-ATP kompleksi replikasyonu başlatabilir. DNA replikasyonu için belirli sayıda DnaA proteini de gereklidir - orijin her kopyalandığında, DnaA için bağlanma bölgelerinin sayısı iki katına çıkar ve başka bir replikasyon başlangıcını sağlamak için daha fazla DnaA sentezi gerektirir.

E. coli gibi hızlı büyüyen bakterilerde kromozom replikasyonu hücrenin bölünmesinden daha fazla zaman alır. Bakteriler, bir önceki sona ermeden önce yeni bir replikasyon turu başlatarak bunu çözerler. Yeni replikasyon döngüsü, bölünen hücreden iki nesil sonra doğan hücrenin kromozomunu oluşturacaktır. Bu mekanizma, örtüşen çoğaltma döngüleri oluşturur.

DNA replikasyonu ile ilgili sorunlar

Replikasyon çatalı, replikasyon stresinin ardından homolog rekombinasyon ile yeniden başlar
Durdurulmuş çoğaltma çatallarındaki nükleozom yeniden birleştirme kusurlarının epigenetik sonuçları

Aşağıdakiler de dahil olmak üzere, çoğaltma stresine katkıda bulunan birçok olay vardır:

Polimeraz zincirleme reaksiyonu

Araştırmacılar genellikle polimeraz zincir reaksiyonunu (PCR) kullanarak DNA'yı in vitro kopyalar . PCR, şablon DNA'daki bir hedef bölgeyi yaymak için bir çift primer kullanır ve daha sonra termostabil bir DNA polimeraz kullanarak bu primerlerden her yönde partner iplikleri polimerize eder . Bu işlemi birden fazla döngü boyunca tekrarlamak, hedeflenen DNA bölgesini büyütür. Her döngünün başlangıcında, şablon ve primerlerin karışımı ısıtılır ve yeni sentezlenen molekül ve şablon birbirinden ayrılır. Daha sonra karışım soğudukça bunların her ikisi de yeni primerlerin tavlanması için şablon haline gelir ve polimeraz bunlardan uzanır. Sonuç olarak, hedef bölgenin kopya sayısı her turda iki katına çıkar ve katlanarak artar .

Ayrıca bakınız

Notlar

Referanslar