DNA polimeraz I - DNA polymerase I
| DNA polimeraz I | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Klenow Fragmentindeki (solda) ve DNA Polimeraz I'deki (sağda) fonksiyonel alanlar.
| |||||||
| tanımlayıcılar | |||||||
| organizma | |||||||
| Sembol | polA | ||||||
| Entrika | 948356 | ||||||
| PDB | 1 DPI | ||||||
| RefSeq (Koruma) | NP_418300.1 | ||||||
| UniProt | P00582 | ||||||
| Diğer veri | |||||||
| EC numarası | 2.7.7.7 | ||||||
| Kromozom | genom: 4.04 - 4.05 Mb | ||||||
| |||||||
DNA polimeraz I (veya Pol I ), prokaryotik DNA replikasyonu sürecine katılan bir enzimdir . Arthur Kornberg tarafından 1956'da keşfedildi , bilinen ilk DNA polimerazdı (ve herhangi bir polimeraz türünün ilk bilineni ). Başlangıçta E. coli'de karakterize edildi ve prokaryotlarda her yerde bulunur . Olarak , E. coli ve diğer bakteriler, gen Pol I kodlayan olarak bilinen Pola . E.coli Pol I enzim amino asitler 928 oluşur ve bir örneğidir olduğu ilerleyici bir enzim - bu, sırasıyla tek iplikçikli şablon bırakmadan birden fazla polimerizasyon aşamaları katalize edebilir. Pol I'in fizyolojik işlevi esas olarak hasarlı DNA'nın onarımını desteklemektir, ancak aynı zamanda RNA primerlerini silerek ve ribonükleotitleri DNA ile değiştirerek Okazaki fragmanlarının bağlanmasına da katkıda bulunur .
keşif
1956'da Arthur Kornberg ve meslektaşları , bir DNA sentezi tahlili geliştirmek için Escherichia coli ( E. coli ) ekstrelerini kullanarak Pol I'i keşfettiler . Bilim adamları , RNA'nın değil, DNA'nın radyoaktif bir polimerinin alınabilmesi için 14 C etiketli timidin eklediler . DNA polimerazın saflaştırılmasını başlatmak için araştırmacılar , E. coli özüne streptomisin sülfat eklediler . Bu, özü, bir nükleik asit içermeyen süpernatan (S-fraksiyonu) ve nükleik asit içeren çökelti (P-fraksiyonu) olarak ayırdı. P-fraksiyonu ayrıca Pol I ve DNA sentez reaksiyonları için gerekli ısıya dayanıklı faktörleri de içeriyordu. Bu faktörler , nükleik asitlerin yapı taşları olan nükleosit trifosfatlar olarak tanımlandı . S-fraksiyonu çoklu deoksinükleosit kinazlar içeriyordu . 1959'da Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü, " Ribonükleik asit ve Deoksiribonükleik Asit'in biyolojik sentezinde yer alan mekanizmaları keşfettikleri için" Arthur Kornberg ve Severo Ochoa'ya verildi .
Yapı ve işlev
Genel yapı
Pol I esas olarak hasarlı DNA'nın onarımında işlev görür. Yapısal olarak, Pol I, düzensiz dizilerde α-helis ve β-ipliklerinin meydana geldiği proteinleri kapsayan alfa/beta protein süper ailesinin bir üyesidir. E. coli DNA Pol I, üç farklı enzimatik aktiviteye sahip çoklu alanlardan oluşur. Genellikle başparmak, parmak ve avuç içi alanı olarak adlandırılan üç alan, DNA polimeraz aktivitesini sürdürmek için birlikte çalışır. Avuç içi alanının yanındaki dördüncü bir alan , düzeltme okuması olarak bilinen bir işlemde 3' ila 5' yönünde yanlış birleştirilmiş nükleotitleri ortadan kaldıran bir eksonükleaz aktif bölgesi içerir . Beşinci bir alan, DNA veya RNA'yı 5' ila 3' yönünde uzaklaştıran ve DNA replikasyonu sırasında veya DNA onarım işlemleri sırasında DNA'nın RNA primerinin çıkarılması için gerekli olan başka bir eksonükleaz aktif bölgesini içerir .
E. coli bakterisi 5 farklı DNA polimeraz üretir: DNA Pol I, DNA Pol II, DNA Pol III, DNA Pol IV ve DNA Pol V. Ökaryotik hücreler 5 farklı DNA polimeraz içerir: α, β, γ, δ ve ε. Ökaryotik DNA polimeraz β en çok E. coli DNA Pol I'e benzer, çünkü ana işlevi replikasyondan ziyade DNA onarımı ile ilişkilidir. DNA polimeraz β esas olarak baz eksizyon onarımı ve nükleotit eksizyon onarımında kullanılır. Toplam 15 insan DNA polimerazı tanımlanmıştır.
Diğer polimerazlara yapısal ve işlevsel benzerlik
DNA replikasyonunda, önde gelen DNA zinciri, replikasyon çatalı hareketi yönünde sürekli olarak uzar, oysa DNA gecikmeli dizisi, Okazaki fragmanları olarak zıt yönde süreksiz olarak ilerler . DNA polimerazlar ayrıca DNA zincirlerini başlatamazlar, bu nedenle kısa RNA veya primerler olarak bilinen DNA segmentleri tarafından başlatılmaları gerekir. DNA polimerizasyonunun gerçekleşmesi için iki şartın karşılanması gerekir. Her şeyden önce, tüm DNA polimerazların hem şablon sarmalı hem de primer sarmalı olması gerekir. RNA'dan farklı olarak, DNA polimerazlar bir şablon iplikten DNA sentezleyemezler. Sentez , Primaz tarafından 5' ila 3' yönünde sentezlenen RNA primeri olarak bilinen kısa bir RNA segmenti tarafından başlatılmalıdır . DNA sentezi daha sonra önceden var olan DNA zincirinin veya RNA primerinin sonundaki 3' hidroksil grubuna bir dNTP eklenmesiyle gerçekleşir. İkinci olarak, DNA polimerazlar, önceden var olan zincire yalnızca hidrojen bağı yoluyla yeni nükleotidler ekleyebilir. Tüm DNA polimerazlar benzer bir yapıya sahip olduklarından, hepsi iki metal iyon katalizli polimeraz mekanizmasını paylaşırlar. Metal iyonlarından biri primer 3' hidroksil grubunu aktive eder ve bu daha sonra dNTP'nin birincil 5' fosfatına saldırır. İkinci metal iyonu, çıkan oksijenin negatif yükünü stabilize edecek ve ardından çıkan iki fosfat grubunu şelatlayacaktır.
DNA polimerazların polimeraz alanlarının X-ışını kristal yapıları, insan sağ ellerine benzer şekilde tarif edilir. Tüm DNA polimerazları üç alan içerir. "Parmak alanı" olarak bilinen ilk alan, dNTP ve eşleştirilmiş şablon tabanı ile etkileşime girer. "Parmak alanı" da şablonla etkileşime girerek onu etkin sitede doğru şekilde konumlandırır. "Avuç içi alanı" olarak bilinen ikinci alan, fosforil grubunun transferinin reaksiyonunu katalize eder. Son olarak, "başparmak alanı" olarak bilinen üçüncü alan, çift sarmallı DNA ile etkileşime girer. Eksonükleaz alanı, kendi katalitik bölgesini içerir ve yanlış eşleştirilmiş bazları ortadan kaldırır. Yedi farklı DNA polimeraz ailesi arasında, "avuç içi alanı" bu ailelerin beşinde korunur. "Parmak alanı" ve "başparmak alanı", farklı dizilerden gelen değişen ikincil yapı elemanları nedeniyle her ailede tutarlı değildir.
İşlev
Pol I, dört enzimatik aktiviteye sahiptir:
- Bir 5 '→ 3' , 3' gerektiren (ileri) bir DNA bağımlı DNA polimeraz aktivitesi, primer bölgesi ve bir template şeridini
- Bir 3 '→ 5' (ters) eksonükleaz aracılık eden bu faaliyeti redaksiyon
- DNA onarımı sırasında nick translasyonuna aracılık eden 5'→3' (ileri) eksonükleaz aktivitesi .
- 5'→3' (ileri) RNA'ya bağımlı DNA polimeraz aktivitesi. Pol I, DNA şablonlarından çok daha düşük verimlilikle (%0.1-0.4) RNA şablonları üzerinde çalışır ve bu aktivite muhtemelen yalnızca sınırlı biyolojik öneme sahiptir.
Pol I'in öncelikle DNA replikasyonu için mi yoksa DNA hasarının onarımı için mi kullanıldığını belirlemek için, eksik bir Pol I mutant E. coli suşu ile bir deney yapıldı . Pol I içermeyen mutant suş izole edildi ve bir mutajen ile tedavi edildi. Mutant suş, normal olarak büyümeye devam eden ve Pol I'den yoksun bakteri kolonileri geliştirdi. Bu, Pol I'in DNA replikasyonu için gerekli olmadığını doğruladı. Bununla birlikte, mutant suş, UV ışığı gibi DNA'ya zarar veren belirli faktörlere karşı aşırı hassasiyet içeren özellikler de sergiledi . Böylece bu, Pol I'in DNA replikasyonundan ziyade DNA hasarının onarımında yer alma olasılığının daha yüksek olduğunu doğruladı.
mekanizma
Çoğaltma işlemi olarak, Rnaz H kaldırır RNA (yarattığı primer primaz gelen) geri kalmış telin ve daha sonra, gerekli doldurur Polimeraz nükleotid arasında Okazaki parçaları (bkz DNA replikasyonunu hatalar için düzeltme okuması, bir 5 '→ 3' yönünde) giderse. Bu, şablona bağımlı bir enzimdir; yalnızca , şablon görevi gören mevcut bir DNA zinciriyle doğru şekilde baz çifti oluşturan nükleotidleri ekler . Bu nükleotidlerin, DNA ligazının çeşitli fragmanları sürekli bir DNA zincirinde bir araya getirebilmesi için DNA şablon zinciriyle baz çifti oluşturmak için uygun oryantasyon ve geometride olması çok önemlidir . Polimeraz I çalışmaları, farklı dNTP'lerin polimeraz I üzerindeki aynı aktif bölgeye bağlanabileceğini doğrulamıştır. Polimeraz I, farklı dNTP'ler arasında ancak konformasyonel bir değişiklik geçirdikten sonra aktif olarak ayrım yapabilir . Bu değişiklik meydana geldiğinde, Pol I, bağlı dNTP ile şablon iplikteki eşleşen bir baz arasında oluşturulan baz çiftinin uygun geometrisini ve uygun hizalanmasını kontrol eder. A=T ve G≡C baz çiftlerinin doğru geometrisi, aktif bölgeye sığabilecek olanlardır . Bununla birlikte, her 10 bir olduğunu bilmek önemlidir 4 10 için 5 nükleotid yanlış ilave edilir. Yine de Pol I, seçici aktif ayrım yöntemini kullanarak DNA replikasyonundaki bu hatayı düzeltebilir.
Erken karakterizasyonuna rağmen, polimeraz I'in çoğu DNA sentezinden sorumlu enzim olmadığı çabucak ortaya çıktı - E. coli'de DNA replikasyonu yaklaşık 1.000 nükleotid/saniye hızında ilerlerken, polimeraz I ile baz çifti sentezi hızı ortalama olarak sadece 10 arasında değişir. ve 20 nükleotid/saniye. Ayrıca, hücre başına yaklaşık 400 molekül hücresel bolluğu iki tipik olduğu gerçeği ile korelasyon çoğaltma çatal bölgesindeki E. coli . Ayrıca, yetersiz olduğu ilerleyici bir bütün kopyalamak genomu sadece 25-50 birleşmeyle sonra düşer gibi nükleotidler . Replikasyondaki rolü, 1969'da John Cairns , polimeraz aktivitesinden yoksun, canlı bir polimeraz I mutantını izole ettiğinde kanıtlandı . Cairns'in laboratuvar asistanı Paula De Lucia, E. coli kolonilerinden binlerce hücresiz ekstrakt yarattı ve bunları DNA-polimeraz aktivitesi için tahlil etti. 3.478. klon , Cairns tarafından "Paula" [De Lucia] olarak adlandırılan polA mutantını içeriyordu . Ana replikatif DNA polimerazın nihayet tanımlanması , DNA polimeraz III'ün keşfine kadar değildi .
Araştırma uygulamaları
E. coli'den elde edilen DNA polimeraz I , moleküler biyoloji araştırmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır . Bununla birlikte, 5'→3' eksonükleaz aktivitesi, onu birçok uygulama için uygunsuz kılar. Bu istenmeyen enzimatik aktivite, moleküler biyolojide yaygın olarak kullanılan Klenow fragmanı adı verilen faydalı bir molekülü bırakmak için holoenzimden basitçe çıkarılabilir . Aslında, Klenow fragmanı, 1976'da ısıya dayanıklı Taq Polimeraz I'in kaynağı olan Thermus aquaticus keşfedilene kadar polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyonunun ilk protokolleri sırasında kullanıldı . DNA polimeraz I'in proteaz subtilisin yarıklarına maruz kalması molekülü, yalnızca DNA polimerazı ve düzeltme okuma etkinliklerini koruyan daha küçük bir parçaya dönüştürür.
